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汾酒是我国清香型白酒的典型代表,其采用了优质、无污染的高粱、大麦和豌豆,好的原料加上杏花村汾酒人精心酿造“清蒸二次清,固态地缸分离发酵,清字当头,一清到底”的传统工艺,酿造出了品质超群的汾酒。 调味酒是一种某些成份含量高而有特殊口味,通过添加少量调味酒变成特定酒体的风味,以达到调味和增香效果的特殊品种的酒。汾酒的主体香成分之一乳酸乙酯,是汾酒中不可或缺的重要组成成分,其含量的多少直接影响汾酒的品质。 在本文的前期研究中,对汾酒酒醅中可能存在的乳酸乙酯功能菌进行了筛选,筛选结果为汾酒酒醅中不存在乳酸乙酯功能菌,那么,酒醅中乳酸乙酯的合成必然是通过微生物胞外酶催化得到。于是,选择了另一种酶催化的方式合成乳酸乙酯。经过大量实验,最终确定了酯化脂肪酶催化和红曲霉酯化酶催化两条途径合成乳酸乙酯。 在选择酯化脂肪酶作为催化剂时,首先进行了水相中酶用量、底物乳酸和乙醇摩尔比(其中保持乳酸浓度为5%)、反应时间、反应温度和pH等影响酶促反应的单因素实验,在单因素实验结果的基础上,采用了正交试验法对酯化脂肪酶催化合成乳酸乙酯的条件进行了优化,最终得到的最优条件为在反应溶液pH为4时,乙醇与乳酸的摩尔比4∶1,加酶量0.5%,反应温度为40℃,反应时间84h,摇床转速为180r/min,在此条件下,乳酸乙酯的理论产率可达2.62g/L。在确定了水相中酯化脂肪酶催化合成乳酸乙酯的条件,选用分离自汾酒酒醅的乳杆菌(Lactobacillus)R-8进行乳酸发酵,得到底物乳酸发酵液(乳酸含量为50-60g/L),将与汾酒基酒进行酯化脂肪酶的混合催化反应,得到的乳酸乙酯产率可达2.5g/L。 在对红曲霉酯化酶建立的催化体系进行研究时,利用自汾酒大曲中分离获得的产酯能力较高的红曲霉菌株,采用正交试验法,以酯化酶活性为检测指标,优化并确定了红曲霉发酵培养基配方和培养条件,并采用响应面优化法对其酯化酶的催化条件进行了优化,并最终确定了最佳的催化条件。在相关实验的基础上,得到了最佳的发酵培养基配方为麸皮和水,二者质量比为1∶1。得到的红曲霉产酯化酶最佳发酵条件为接种量为1%,发酵温度为30℃,发酵时间为4d。按照以上确定的红曲霉产酯化酶的最佳发酵培养基配方及培养条件,将发酵产物经32℃烘干、磨碎,即制备了红曲霉酯化酶粗酶制剂。在对红曲霉酯化酶催化合成乳酸乙酯进行优化时,采用中心组合设计方法(CCD法)对醇酸摩尔比、加酶量、反应时间和反应温度四个因素进行优化,得到的最佳催化条件为醇酸摩尔比6,加酶量1.5%,反应时间60h,反应温度30℃,转速为180r/min,乳酸乙酯生成量的平均值为3.38g/L。同上,将底物乳酸发酵液(乳酸含量为50-60g/L),与汾酒基酒进行酯化脂肪酶的混合催化反应,乳酸乙酯生成量可稳定在3.5g/L。 由于乳酸乙酯难挥发,且沸点高(达到155℃),采用减压蒸馏的方法提取乳酸乙酯,该过程为真空度0.06MP,蒸馏温度60-70℃,蒸馏时间为50min,即获得乳酸乙酯调味酒,乳酸乙酯含量能够达到2g/L,回收率为66.7%。 综上所述,最终初步建立了乳酸乙酯上游催化工艺和下游提取工艺,制定了技术路线,确定了相关的技术参数,初步获得了乳酸乙酯调味酒新产品。