第一部分不同tau亚型对神经细胞增殖的影响及机制　　研究背景：　　Tau是一种微管相关蛋白，其异常在神经退行性疾病的发生发展中起重要作用。在人的中枢神经系统中，由于外显子2、3和10的选择性剪切，可产生六种tau亚型。Tau亚型在不同脑区表达不一致；在神经系统的发育和疾病发生过程中，tau亚型的表达也存在差异。但是，六种tau亚型的生物学意义目前尚不清楚。　　目的：　　观察不同tau亚型对神经细胞增殖的影响及机制。　　方法:　　采用脂质体法分别将六种表达 tau亚型的质粒 pEGFP-tau-0N3R、pEGFP-tau-1N3R、 pEGFP-tau-2N3R、 pEGFP-tau-0N4R、 pEGFP-tau-1N4R和pEGFP-tau-2N4R瞬时转染N2a细胞，转染pEGFP空载体作为对照。转染后48 h，western blot检测不同tau亚型质粒的转染效率。转染后48 h，采用CCK8检测不同tau亚型对细胞活性的影响，采用 BrdU掺入法免疫荧光检测不同 tau亚型对细胞增殖的影响，采用流式细胞技术检测转染后细胞周期分布的变化。分别提取细胞总蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白，采用western blot检测细胞周期相关蛋白cyclin A、cyclin B1、cyclin D1、cyclin E、Cdk2和Cdk4的表达变化。转染后48 h，采用神经突起生长试剂盒检测不同tau亚型对N2a细胞突起生长的影响。　　结果:　　1.转染后48 h，western blot检测发现转染不同质粒的细胞eGFP-tau融合蛋白表达差异无统计学意义，说明各组间细胞转染效率无明显差异。　　2. CCK8检测发现，与转染对照质粒比，转染1N3R-tau的N2a细胞活性明显下降（P<0.05），转染其他tau亚型的细胞活性变化无统计学差异（P>0.05）；BrdU掺入法检测发现，与转染对照质粒比，转染1N3R-tau的BrdU阳性细胞数显著减少（P<0.05），转染其它 tau亚型的 BrdU阳性细胞数无统计学差异（P>0.05），说明1N3R-tau亚型可抑制细胞增殖。　　3.流式细胞技术检测发现，与转染对照质粒比，转染六种tau亚型的N2a细胞的细胞周期分布差异无统计学意义。由于N2a细胞的转染效率为50-60％，而HEK293细胞的转染效率能达到80-90%。进一步检测转染六种tau亚型的HEK293细胞的细胞周期分布发现，与转染对照质粒比，各组间SubG1细胞数差异无统计学意义，转染1N3R-tau的HEK293细胞G1期细胞减少，S期细胞增多，G2/M期细胞减少，转染其它tau亚型的HEK293细胞的细胞周期分布差异无统计学意义。说明1N3R-tau亚型诱导细胞周期S期阻滞。　　4. western blot检测发现，与转染对照质粒比，转染1N3R-tau和2N4R-tau的N2a细胞的细胞周期相关蛋白cyclin A、 cyclin B1、cyclin D1、cyclin E、Cdk2和Cdk4总蛋白表达无显著变化；与转染对照质粒比，转染1N3R-tau的N2a细胞中Cyclin E的浆核比例增高，其他蛋白cyclin A、 cyclin B1、cyclin D1、Cdk2和Cdk4的浆核比例表达无统计学差异。说明1N3R-tau亚型促使Cyclin E从胞核向胞浆转移。　　5.采用神经突起生长试剂盒检测发现，与转染对照质粒比，转染tau亚型的N2a细胞的神经突起生长明显（P<0.05），但是不同tau亚型之间没有差异（P>0.05）。结论　　1N3R-tau亚型通过诱导cyclin E从胞核向胞浆转移，使细胞出现S期阻滞，从而抑制N2a细胞增殖。　　第二部分CA3区过表达不同tau亚型对小鼠学习记忆的影响及机制　　研究背景:　　阿尔茨海默病的典型临床表现是进行性记忆丧失。其分子机制之一是异常磷酸化的 tau蛋白形成神经原纤维缠结沉积在细胞中，从而损伤学习记忆能力。Tau蛋白根据外显子2、3和10的选择性剪切可以产生六种亚型。六种tau亚型对学习记忆的影响尚不清楚。　　目的:　　探讨六种tau亚型对学习记忆的影响和机制。　　方法：　　采用脑立体定位注射技术分别将六种表达tau亚型的腺相关病毒注射到8-10周龄C57雄性小鼠海马CA3区，构建CA3区过表达tau亚型的小鼠模型；病毒表达一个月后，采用旷场实验检测小鼠的运动能力和焦虑情绪；采用十字高架迷宫实验检测表达不同tau亚型小鼠的焦虑情绪；采用Morris水迷宫和情景条件恐惧实验检测小鼠的学习记忆能力；采用 LTP检测突触可塑性；采用 western blot检测突触相关蛋白synaptophysin、synaptotagmin、GluR1、GluR2、NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、PSD95和PSD93以及记忆相关蛋白CREB、ERK和SRC的表达水平。　　结果：　　1.行为学结果：①Morris水迷宫实验发现，在小鼠训练期间，与对照组比，2N4R组（第3天）、0N4R组和2N3R组（第6天）找到平台的时间明显增加（P<0.05）。其次，在检测小鼠记忆水平时，与对照组比，其它各组小鼠在目的象限停留时间并没有显著差异；但是，与对照组比，1N3R找到平台的潜伏期增加（P<0.05）；与对照组比，其它五种tau亚型小鼠穿越平台的次数减少，其中0N4R和2N4R组最明显（P<0.05）。②情景条件恐惧实验发现，与对照组比，表达2N4R-tau的小鼠其僵直时间明显下降（P<0.05）。③旷场实验提示，与对照组比，不同 tau亚型小鼠在运动能力和情绪上没有发现显著改变。④高架十字迷宫实验中，与对照组比，不同 tau亚型小鼠没有情绪上的显著改变。结果①和②提示小鼠有工作记忆损伤。　　2.与对照组比，表达 tau亚型的小鼠兴奋性突触后电位（fEPSP）水平均下降（P<0.0001），其中2N4R下降最明显（P<0.05），提示突触传递功能（LTP）损伤。　　3.与对照组比，不同tau亚型小鼠海马的突触相关蛋白synaptophysin、synaptotagmin、GluR1、GluR2、NMDAR2A和NMDAR2B表达水平没有明显变化。但是，除2N4R-tau外，其他tau亚型小鼠海马内突触相关蛋白NMDAR1、PSD95、PSD93表达升高。　　4.与对照组比，表达tau亚型小鼠的CREB磷酸化水平均升高（P<0.05），但是ERK磷酸化水平没有变化；并且，只有2N4R-tau小鼠SRC总蛋白表达升高，但是其磷酸化水平没有变化。　　结论：　　过表达不同tau亚型均损伤小鼠的学习记忆能力，其中表达2N4R-tau的损伤作用最强，其分子机制可能涉及SRC的过表达。　　第三部分CA3区分别过表达3R-tau和4R-tau混合物对小鼠学习记忆的影响及机制　　研究背景：　　由于微管重复序列中外显子10的选择性剪切，tau蛋白可以分成3R和4R两种亚型。4R-tau的微管结合能力强于3R-tau。正常成人脑中，4R与3R的比例大致为1，而在AD患者脑中4R与3R的比例升高。目前，没有比较4R-tau和3R-tau对学习记忆影响的相关研究。　　目的：　　探讨3R-tau和4R-tau对学习记忆的影响是否存在差异以及可能涉及的机制。　　方法：　　将AAV-tau-0N3R，AAV-tau-1N3R和AAV-tau-2N3R三种病毒等体积混合，即为3R-tau病毒。将AAV-tau-0N4R，AAV-tau-1N4R和AAV-tau-2N4R三种病毒等体积混合，即为4R-tau病毒。采用脑立体定位注射技术在小鼠海马CA3区注射表达3R-tau和4R-tau亚型的腺相关病毒，构建CA3区过表达3R-tau和4R-tau亚型的小鼠模型；病毒表达一个月后，采用旷场实验检测表达3R-tau和4R-tau小鼠的运动能力和焦虑情绪；采用高架十字迷宫实验进一步检测表达3R-tau和4R-tau小鼠的焦虑情绪；采用Morris水迷宫实验检测表达3R-tau和4R-tau小鼠的学习记忆能力；采用LTP检测表达3R-tau和4R-tau小鼠的突触可塑性。　　结果：　　1. Morris水迷宫实验发现，与对照组比，在学习训练期间，表达3R-tau的小鼠潜伏时间明显增加（P<0.05）；在记忆检测时，表达3R-tau的小鼠其目的象限停留时间明显减少（P<0.05），提示表达3R-tau损伤小鼠的空间学习记忆能力。　　2.旷场实验提示，与对照组比，表达3R-tau和4R-tau小鼠在运动能力和情绪上没有改变。　　3.高架十字迷宫实验中，表达3R-tau和4R-tau小鼠与对照组比没有显著差异，提示表达3R-tau和4R-tau小鼠的情绪没有改变。　　4.与对照组比，3R-tau和4R-tau小鼠的LTP水平均下降（P<0.0001），其中3R-tau下降更明显（P<0.05），提示过表达3R-tau和4R-tau影响小鼠的突触传递功能。结论　　过表达3R-tau混合物对小鼠学习记忆的损伤比4R-tau混合物更加明显。