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在干旱半干旱地区的富硼土壤和涉硼企业的硼污染,对动植物的生长发育具有严重的负面影响。国外学者和我们课题组的前期研究表明,杨树可将硼富集在叶片中,适用于对富硼土壤进行生物修复。然而木本植物杨树中相关的分子方面的研究非常少。本课题组已分析了硼运蛋白家族(BOR)在硼胁迫条件下不同组织中的表达模式,筛选克隆BOR的关键基因的基础之上。本实验分析俄罗斯杨和毛白杨的耐硼性状;通过构建超量表达载体和RNA干涉载体,转化毛白杨,研究BOR在硼转运、分配和富集过程中的功能;通过构建BORpro::GUS转化毛白杨,研究BOR基因启动子的组织特异性及其对硼胁迫的应答模式;通过转化拟南芥,分析杨树BOR亚细胞定位。取得的研究成果如下:1.俄罗斯杨和毛白杨对硼的耐硼性状及BOR家族的表达模式对俄罗斯杨和毛白杨的水培苗进行不同硼浓度梯度(CK-50uM、1mM、5mM、10mM)的处理。实验表明,俄罗斯杨在10mM硼胁迫一周后,叶片变黄变卷,而毛白杨在10mM硼胁迫4天后,叶片出现大量黑色斑。通过硼含量的测定,在高硼胁迫中植物主要将硼集中在叶片进行排毒。在BOR家族中,高硼的胁迫下的PrBOR7和PtoBOR7表达水平随着胁迫时间增加而显著升高。2.俄罗斯杨BOR7基因功能本研究构建好的35Spro::PrBOR7载体通过叶盘转化法转化毛白杨。共得到组培杨树30株,其中阳性杨树23株,阳性率为76.67%;通过实时荧光定量PCR分析,筛选出BOR7表达高的三个株系1号、13号、19号,表达量分别是野生型毛白杨的80倍、40倍、50倍。对异源表达PrBOR7基因的毛白杨先进行了高硼处理。在水培的实验中,设计4种不同硼浓度梯度(CK-50uM、1mM、5mM、10mM)的处理。实验表明,在10mM硼胁迫的第三天,转基因毛白杨比野生型率先出现少量坏死黑斑;第四天,10mM硼胁迫的转基因毛白杨比野生型有更多的黑斑,且5mM硼胁迫的转基因毛白杨比野生型率先出现黑斑。在测定硼含量中,过表达株系的叶片中比野生型叶片还有更多的硼。说明了转基因植株更快地吸收了硼,导致转基因比野生型更早出现硼胁迫表型。对异源表达PrBOR7基因的毛白杨又进行了低硼处理。低硼浓度(5uM)处理一个月,发现转基因毛白杨比野生型的植株长地更高,出芽速度更快。通过测定各部位的硼含量,在树、皮和芽部位,过表达株系在根部的硼含量显著高于野生型,表明硼的含量影响着植物的生长,推测了PrBOR7可能具有吸收硼的功能。3.干扰载体的构建与转基因苗的筛选首先构建干扰表达载体,转化毛白杨后共得到组培杨树100多棵,其中阳性杨树80棵,阳性率约为80%,通过实时荧光定量PCR分析,筛选出BOR7表达最低的三个株系41号、70号、76号,表达量分别是野生型毛白杨的0.08倍、0.3倍、0.2倍。4.BOR7的GUS染色组织定位和亚细胞定位将PrBOR7pro::GUS植物表达载体转化毛白杨,得到了组培杨树。分析了PrBOR7启动子的转基因株系的组织表达差异。初步表明PrBOR7在正常水平下,主要在茎和老叶片部位表达,根上基本不表达。在拟南芥原生质体中,瞬时转后的绿色荧光蛋白显示PeBOR7的主要位点在细胞膜和细胞核上。