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猪圆环病毒(PCV)是圆环病毒科圆环病毒属单股环状DNA病毒。根据抗原性和基因型的不同,分为PCV1、PCV2和PCV3三种血清型。PCV1最早于1974年被发现,认为是传代细胞PK-15培养的污染物,对猪不具有致病作用,在很多国家的猪体内普遍存在,而不产生临床症状。PCV2常引起以断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)为代表的猪圆环病毒相关疾病(PCVAD),给养殖业带来巨大的危害。2016年,美国的Phan T和Palinski R几乎同一时间在不同地区的农场中检测出新型圆环病毒(PCV3)。随后,PCV3在中国、韩国、巴西等10多个国家相继被检出并报道,现已成世界性分布,给养猪业带来了极大的威胁。贵州省关于PCV3的流行病学调查及相关基因研究尚未见详细报道。本研究对贵州省PCV3的流行情况进行了分子流行病学调查,基于基因组序列进行了遗传进化分析,并对PCV3唯一结构蛋白,即主要免疫原性蛋白Cap进行了原核表达研究,为血清学检测方法ELISA试剂盒的研究奠定了基础。1.贵州省猪圆环病毒3型病毒分子流行病学调查及流行株基因组分析针对PCV3 ORF2区域设计特异性引物,应用PCR扩增技术,对实验室2012~2018年间收集的贵州省92个规模化养殖场送检的427份样品进行了PCV3 ORF2基因的特异性扩增,并对检测结果进行了归类比较分析。结果显示在427份样品中,91份为PCV3呈阳性,并与CSFV、PRRSV、PCV2、PEDV、PRV等病毒形成双重或多重感染,其中与PRRSV双重感染率高达59.3%;贵州各个地州市均存在PCV3感染,2012~2018年的阳性率逐年上升;贵阳市送检样品中PCV3检出率最高,为26.1%;PCV3阳性检出率最高的猪群系保育猪群,为25%。同时,论文还对部分阳性样品进行了PCV3全基因组的克隆和序列测定,共获得11株PCV3基因组序列,基因组大小均为2 000 bp。遗传进化分析发现11株PCV3中,2株属于PCV3b型,9株属于PCV3c型,未发现有PCV3a存在;各毒株间核苷酸序列相似性在98.9%~100%之间,与国外毒株核苷酸相似性在98.7%~99.8%之间,与国内PCV3毒株相比核苷酸相似性在97.3%~99.9%之间,与PCV2和PCV1相似性在40%左右,遗传关系较远。2.猪圆环病毒3型Cap蛋白原核表达研究为获得PCV3 Cap蛋白,通过设计特异性引物针对Cap基因进行扩增,并将其克隆至pMD19-T载体中,再通过基因工程技术酶切后亚克隆至原核表达载体pET-32a中,经质粒PCR、双酶切及测序鉴定比对正确后,转化入Rosseta(DE3)大肠杆菌表达系统中,对影响诱导的条件即时间、温度、IPTG进行优化,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹试验(Western-blotting)等对表达的PCV3 Cap蛋白进行检测。结果显示成功构建了PCV3 Cap蛋白的原核表达质粒,在最佳表达条件,即1.0 mmol/L的IPTG,37℃诱导4 h后,SDS-PAGE电泳检测可在约43.1 KDa处检测到表达的目的蛋白。通过转印将蛋白转移至PVDF膜后,以带His标签的单克隆抗体为一抗,对融合表达蛋白进行Western-blotting检测,结果显示带His标签的单克隆抗体能和融合表达的目的蛋白特异性结合并显色。本研究为PCV3血清学鉴别诊断方法建立及ELISA试剂盒的研究奠定了基础。