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水稻白叶枯病(Bacterial blight,BB)曾被列为水稻的三大病害之一,由黄单胞杆菌水稻变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)引起,发病严重时对水稻的品质及产量均危害严重。结合水稻的抗病机制研究,运用水稻育种新技术来培育抗性品种,是防治水稻白叶枯病等病害的最有效的办法。本研究一方面筛选负调控水稻抗性的相关基因,借助CRISPR/Cas9基因编辑技术,在性状优良的水稻品种中进行基因敲除,从而获得类似于自发突变的新型材料;另一方面延续实验室前期的研究,结合转录组数据,对OsWRKY28基因在水稻抗白叶枯病以及褐飞虱中的功能研究进行初步分析。研究的主要内容包括以下几点:1.运用适用于多靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,构建了靶向OsPi21和OsBON1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体,经农杆菌介导的水稻遗传转化方法获得了水稻日本晴转基因植株,检测并得到了相关转基因突变材料。在验证多靶点基因编辑载体的同时,也为应用基础研究和育种研究拓展了材料。2.对OsWRKY28基因进行启动子元件分析,在Plant CARE网站上分析后发现,其含有多个响应激素如MeJA、ABA、GA和IAA等的元件,其中响应MeJA的元件有4个。除此之外,还有响应生物胁迫的TC重复区域,响应非生物胁迫的低温应答元件以及类黄酮合成调控元件等。3.定量PCR结果显示:OsWRKY28基因的表达受MeJA、GA和IAA诱导。OsWRKY28基因由于能够感受这些激素的变化,且表达受到这些激素的调控,因此推测其可能参与MeJA等介导的抗性信号通路。4.转录组结果显示:OsWRKY28过表达植株与野生型植株相比有1287个基因出现2倍以上差异表达,其中有807个上调,480个下调。OsWRKY28-Cas9转基因植株中有2293个基因差异表达,包括1594个上调表达基因和699个下调表达基因。这些基因中包括抗病虫相关调控基因NPRs和OsLecRKs,激素合成相关关键基因OsICS、OsLOXs、OsEILs等以及转录因子家族基因如OsWRKYs、OsbZIPs、OsNACs等。这些基因的差异表达预示着OsWRKY28可能参与激素介导的抗病虫害信号调控通路。5.对Dongjing(Oryza sativa Japonica cv.Dongjin,DJ)为背景的T-DNA插入纯合突变体水稻植株进行接菌实验,结果显示:普通的DJ水稻在接菌14天后的平均病斑长于T-DNA插入突变体水稻株系。对普通的日本晴水稻和以日本晴为背景的OsWRKY28转基因过表达材料以及CRISPR/Cas9基因敲除转基因材料进行白叶枯菌接菌实验,14天后进行病斑统计,统计结果为:OsWRKY28超表达材料病斑长度略高于日本晴,而敲除后的OsWRKY28材料病斑长度略低于超表达材料。两种材料的接菌抗性鉴定结果相一致,由此证推测OsWRKY28转录因子在水稻对白叶枯病的抗性中其负调控作用。6.通过对DJ和DJ为背景的T-DNA插入突变体进行褐飞虱抗性鉴定。初步结果表明:在对14天苗龄的DJ(对照组)和OsWRKY28的T-DNA插入突变体(实验组)进行接虫试验,OsWRKY28的T-DNA插入突变体材料叶片出现叶片萎蔫,整个株型较弱的表型,推测其对褐飞虱的抗性略弱于野生型DJ材料。