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第一章：10%高渗盐水减轻缺血再灌注脑损伤所致脑水肿与调控NKCC1表达的关系目的：评价10%高渗盐水(hypertonic saline,HS)治疗缺血再灌注脑损伤所致脑水肿的效果,探讨其与10%高渗盐水调控缺血灶周围皮层脑组织星形胶质细胞上钠、钾、氯同向转运蛋白-1(Na-K+-Cl--cotransporterl(NKCC1)表达的关系。材料与方法：1.实验动物与分组111只健康成年SD雄性大鼠随机分成3组：假手术组+生理盐水组(简称假手术组,n=37)、脑缺血+生理盐水组(简称脑缺血组,n=37)和脑缺血+10%高渗盐水组(简称10%高渗盐水组,n=37)。右侧大脑中动脉栓塞(1niddle cerebral artery occlusion,MCAO)后2h开始缺血再灌注,为治疗起点,假手术组、脑缺血组用微量注射泵按0.3ml/h经尾静脉匀速注入生理盐水,10%高渗盐水组用微量注射泵按0.3m1/h经尾静脉匀速注入10%高渗盐水,根据治疗持续时间分为12h和24h两个亚组。2.观察指标：①通过干湿比重法测量12h和24h各组缺血侧大脑半球脑含水量(Brain Water Content,BWC)(每组7例)；②TTC (2,3,5,-triphenyltetrazolium chloride monohydrate,TTC)染色法检测24h各组脑梗死面积(每组6例)；③Westernblot检测12h缺血灶周围皮层NKCC1蛋白的变化(每组6例)；④real time RT-PCR检测12h缺血灶周围皮层NKCClmRNA的变化(每组6例)：⑤荧光双标免疫组化法检测24h缺血灶周围皮层NKCC1与GFAP(星形胶质细胞标记蛋白)的共定位表达差异(每组5例)3.数据分析和统计学处理根据资料不同类型,所有数据经SPSS13.0统计软件进行相应的统计处理。服从正态分布的计量资料以(均数±标准差)(x±S)表示；两因素比较采用析因设计的方差分析,单因素组间比较采用one-way ANOVA方差分析。方差齐,组间多重比较采用LSD分析,方差不齐,组间多重比较采用Dunnett’s T3分析；以P<0.05认为差异有统计学意义。结果：1.1.缺血侧大脑半球BWC经析因方差分析,结果显示治疗因素各组间差异有显著性(F=56.620、P<0.001),脑缺血组比假手术组和10%高渗盐水组缺血侧BWC增高；12h、24h两治疗时间点缺血侧BWC差异有显著性意义(F=12.397、P=0.001)；治疗时间与各治疗因素之间无交互作用(F=1.079、P=0.351)。治疗因素不同组别之间差异不随时间变化而变化。进一步分析治疗因素单独效应：分别在治疗12h、24h,采用LSD法进行组间多重比较,同假手术组比较,脑缺血组、10%高渗盐水组缺血侧大脑半球BWC增加(P<0.001)；同脑缺血组比较,10%高渗盐水组BWC减低(P<0.001)。1.2.梗死灶TTC染色TTC染色显示假手术组不存在脑梗死灶；同假手术组相比,脑缺血组缺血再灌注24h脑梗死明显,平均脑梗死体积为348.29±37.78mm3(n=6)；经10%高渗盐水治疗组,同脑缺血组相比,梗死面积明显缩小,平均脑梗死体积为198.41±49.67mm3(n=6),差异具有统计学意义(P<0.05).该结果说明10%高渗盐水可以有效减少缺血再灌注损伤所致的脑梗死面积,具有脑神经保护作用。1.3.缺血灶周围NKCC1-mRNA及蛋白表达情况①方差不齐,采用Welch近似方差分析对12h各组间NKCC1-mRNA表达进行比较,各组间NKCC1-mRNA的表达倍数变化有统计学差异(F=77.619,P<0.001);进一步采用Dunnett T3进行组间多重比较,RT-PCR结果表明：在治疗12h后,同假手术组相比,脑缺血组NKCC1-mRNA表达增高,两者差异有统计学意义(P<0.001),10%高渗盐水治疗组NKCC1-mRNA表达增高,两者差异有统计学意义(P<0.001)；同脑缺血组相比,10%高渗盐水治疗组NKCC1-mRNA表达减低,两者差异有统计学意义(P=0.007)。②采用单因素方差对12h各组间NKCC1蛋白表达进行比较,各组间NKCC1蛋白的表达有统计学差异(F=77.061,P<0.001)；进一步采用LSD进行组间多重比较,Western-blot结果表明：在治疗12h后,同假手术组相比,脑缺血组NKCC1蛋白表达增高,两者差异有统计学意义(P<0.001),10%高渗盐水治疗组NKCC1蛋白表达增高,两者差异有统计学意义(P<0.001)；同脑缺血组相比,10%高渗盐水治疗组NKCC1蛋白表达减低,两者差异有统计学意义(P<0.001)。1.4缺血灶周围NKCC1与GFAP共定位表达情况在治疗24h,与假手术组相比,脑缺血组缺血灶周围脑组织NKCC1的表达出现增高,而经10%高渗盐水治疗组缺血灶周围脑组织NKCC1的表达明显减低。各组NKCC1和GFAP存在不同程度共定位,这也说明10%高渗盐水可以抑制缺血再灌注脑损伤所致星形胶质细胞内NKCC1的表达上升。第二章：10%高渗盐水调控脑缺血再灌注损伤炎症反应与减轻脑水肿的关系目的：探讨10%高渗盐水是否可以通过抑制缺血缺氧激活的小胶质细胞释放TNF-α、IL-1β,减轻炎症反应,从而阻碍缺血性脑水肿的产生,最终减轻脑水肿。材料与方法：1.实验动物与分组102只健康成年SD雄性大鼠随机分成3组：假手术组+生理盐水组(简称假手术组,n=34)、脑缺血+生理盐水组(简称脑缺血组,n=34)和脑缺血+10%高渗盐水组(简称10%高渗盐水组,n=34)。右侧大脑中动脉栓塞(1middle cerebral artery occlusion,MCAO)后2h开始缺血再灌注,为治疗起点,假手术组、脑缺血组用微量注射泵按0.3m1/h经尾静脉匀速注入生理盐水,10%高渗盐水组用微量注射泵按0.3ml/h经尾静脉匀速注入10%高渗盐水,根据治疗持续时间分为12h和24h两个亚组。2.观察指标：①Western blot检测12h缺血灶周围皮层TNF-α、IL-1β蛋白的变化(每组6例)②real time RT-PCR法检测12h缺血灶周围皮层TNF-α、 IL-1β mRNA的变化(每组6例)；③荧光双标免疫组化法检测TNF-α、IL-1β与OX42(小胶质细胞标记蛋白)在缺血灶周围皮层的共定位表达差异(每组5例)。3.数据分析和统计学处理根据资料不同类型,所有数据经SPSS13.0统计软件进行相应的统计处理。服从正态分布的计量资料以(均数±标准差)(x±S)表示；单因素组间比较采用one-way ANOVA方差分析。方差齐,组间多重比较采用LSD分析,方差不齐,组间多重比较采用Dunnett’s T3分析；以P<0.05认为差异有统计学意义。结果：2.1.缺血灶周围TNF-α-mRNA及蛋白表达情况①采用单因素方差分析对12h各组间TNF-α-mRNA表达进行比较,各组间TNF-α-mRNA的表达有统计学差异(F=266.632,P<0.001)；进一步采用LSD进行组间多重比较,结果表明：在治疗12h后,同假手术组相比,脑缺血组TNF-α-mRNA表达增高,两者间差异有统计学意义(P<0.001),10%高渗盐水治疗组TNF-α-mRNA表达增高,两者间差异有统计学意义(P<0.001)；同脑缺血组相比,10%高渗盐水治疗组TNF-α-mRNA表达减低,两者间差异有统计学意义(P<0.001)。②方差不齐,采用Welch近似方差分析对各12h组间TNF-α蛋白表达进行比较,各组间TNF-α蛋白的表达变化有统计学差异(F=44.285,P<0.001)：进一步采用Dunnett T3进行组间多重比较,结果表明：在治疗12h后,同假手术组相比,脑缺血组TNF-α蛋白表达显著增高,差异有统计学意义(P<0.001),10%高渗盐水治疗组TNF-a蛋白表达增高,两者差异有统计学意义(P<0.001)；同脑缺血组相比,10%高渗盐水治疗组TNF-α蛋白表达减低,两者差异有统计学意义(P=0.007)。2.2.缺血灶周围TNF-α与OX42共定位表达情况免疫荧光双标结果显示假手术组小胶质细胞(OX42标记)形态呈分支状,组织形态完整,没有发现明显的TNF-α的表达。脑缺血组在治疗24h后缺血灶周围脑组织结构破坏,TNF-α的表达显著增高,而经10%高渗盐水治疗组TNF-α的表达较脑缺血组显著降低。TNF-α和OX42存在不同程度共定位,这也说明在脑缺血再灌注损伤早期TNF-α的大量表达主要来自激活的小胶质细胞分泌。2.3.缺血灶周围IL-1β-mRNA及蛋白表达情况①采用单因素方差对12h各组间IL-1β-mRNA的表达进行比较,各组间IL-1β-mRNA的表达有统计学差异(F=12.580,P=0.001)；进一步采用LSD进行组间多重比较,结果表明：在治疗12h后,同假手术组相比,脑缺血组IL-1β-mRNA表达增高,两者差异有统计学意义(P<0.001),10%高渗盐水治疗组IL-1β-mRNA表达增高,两者差异没有统计学意义(P=0.103)；同脑缺血组相比,经10%高渗盐水治疗组IL-1β-mRNA表达减低,两者差异有统计学意义(P=0.006)②采用单因素方差分析对12h各组间IL-1p蛋白表达进行比较,各组间IL-1β蛋白的表达有统计学差异(F=32.890,P<0.001)；进一步采用LSD进行组间多重比较,结果表明：在治疗12h,同假手术组相比,脑缺血组IL-1β蛋白表达增高,差异有统计学意义(P<0.001),10%高渗盐水治疗组IL-1β蛋白表达增高,两者差异存在统计学意义(P=0.009)；同脑缺血组相比,经10%高渗盐水治疗组IL-1β蛋白表达减低,两者差异存在统计学意义(P<0.001)2.4.缺血灶周围IL-1β与OX42共定位表达情况免疫荧光双标结果显示假手术组小胶质细胞(OX42标记)形态呈分支状,组织形态完整,没有发现明显的IL-1β的表达。脑缺血组在治疗12h缺血灶周围脑组织IL-1β的表达显著增高,而经10%高渗盐水治疗组IL-1β的表达较脑缺血组显著降低。IL-1β和OX42存在不同程度共定位,这也说明在脑缺血再灌注损伤早期IL-1β的大量表达主要来自激活的小胶质细胞分泌。全文结论：1. MCAO模型所致SD大鼠缺血再灌注损伤可导致缺血侧大脑半球脑含水量增加,缺血再灌注损伤可导致梗死侧缺血灶周围皮层脑组织NKCC1、TNF-α、IL-1β蛋白及mRNA表达增加；2.同生理盐水组相比,10%高渗盐水治疗可使缺血侧大脑半球脑含水量下降,同时抑制缺血灶周围皮层脑组织NKCC1、TNF-α、IL-1β mRNA及蛋白表达；3.10%高渗盐水可以通过抑制缺血缺氧激活小胶质细胞诱发的炎症反应,同时抑制缺血灶周围星形胶质细胞NKCC1的表达,阻碍脑水肿的产生,最终减轻脑水肿。