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香蕉是世界最古老的栽培果树之一,分布于东、西半球的热带和亚热带的广阔地区。我国是香蕉的主产国之一,栽培历史悠久,品种资源比较丰富。由于香蕉本身易变异,且引种频繁,命名混乱,使得香蕉栽培品种的分类研究存在很大的困难。与此同时,全球范围内,香牙蕉品种易受到枯萎病4号生理小种的危害,而香蕉枯萎病是一种香蕉的毁灭性病害,使得世界各地的香蕉产地遭受严重损失,选育抗枯萎病品种被认为是有效的长久之计。
本研究采用RAPD和ISSR分子标记技术,对搜集到的35份香牙蕉品种资源之间的亲缘关系进行了分析,为香蕉种质资源的合理利用提供理论依据;同时,对具有抗香蕉枯萎病潜力的品种进行了抗病相关标记的初步研究,期望为香蕉抗枯萎病的育种工作深入打好基础。获得的主要结果如下:
1、选用改良CTAB法从香蕉幼嫩的蕉叶中提取基因组DNA,使用正交实验设计和温度梯度实验设计构建了一套完善的香蕉RAPD、ISSR分子标记分析体系,为进一步的研究提供了一个平台。
2、运用RAPD和ISSR分子标记技术,全面分析了搜集到的35份香牙蕉品种资源之间的亲缘关系。在RAPD分析中,用107条随机引物扩增获得了890条谱带;在ISSR分析中,用8条ISSR引物扩增获得了101条谱带。利用Ntsys软件绘制了35个香牙蕉品种的亲缘关系树。由数据分析可知,香牙蕉品种亲缘关系非常近,实际相似系数最高的达到0.93,最低的也有0.85。
3、通过RAPD和ISSR分子标记分析,获得了一定数量的香牙蕉品种特异性扩增谱带。即1个香蕉品种特有的谱带,其它34个香蕉品种没有;或34个香蕉品种均有的谱带,而唯独1个香蕉品种缺失。这些谱带为香牙蕉各品种的鉴定提供了基础。
4、利用RAPD+BSA法筛选具有抗枯萎病潜力的香牙蕉品种中可能与抗枯萎病相关的分子标记,获得了一个具有抗枯萎病潜力的香蕉品种“GCTCV-119”与其它感病品种有差异的引物OP-015,随后克隆、测序获得了该引物扩增片段的序列。并且将克隆获得的序列与感病品种巴西同一引物扩增序列进行比较,发现序列之间存在5个核苷酸的差异。
5、应用同源克隆的方法,设计简并引物,克隆具有抗枯萎病潜力的香牙蕉品种“GCTCV-115”、“GCTCV-247”和“GCTCV-119”中R基因类似物。经过测序、比对,得到一个片段与野生蕉(M.acuminata)cloneMuG9的基因组序列高度相似,相似性在90%左右,但并非R基因的保守区域,另一个片段则与野生蕉(M.acuminata)的NBD-25NBS/LRR抗性相关基因的一段序列相似,相似性高达9l%。