近年来，关于衰老方面的研究已成为全世界范围的热点问题。线粒体功能和衰老的发展过程密切相关。首先，线粒体产生自由基，又是氧化损伤的靶标，衰老的心肌产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加，可导致线粒体膜电位丧失和心肌凋亡；其次，衰老的心脏、骨骼肌、肝脏组织中存在线粒体DNA缺失和突变。线粒体DNA损伤能诱导呼吸链复合体的多肽改变，电子传递下降，ROS产生进一步增加；再次，衰老的心脏线粒体的转录和翻译活性受损。比较蛋白质组学作为多基因、多因素复杂病理机制研究的有效手段，可高通量、大规模地筛检在疾病发生发展中起重要作用的关键蛋白质分子，运用该研究策略，可获得一些传统手段无法得到的新蛋白标志物，新关键分子，极大地丰富了诊断标志物的选择组合及复杂致病机理的全面阐明。目前关于老年大鼠心肌线粒体的蛋白质组学及差异蛋白功能分析的研究国内外尚无报道。本研究通过对新生期，成年期，老年期三个不同发育阶段SD大鼠心肌线粒体的全蛋白质组表达谱进行差异分析，筛出了一些差异蛋白质，并对其中的差异分子乙醛脱氢酶2(Aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)，用Western Blot，RT-PCR，基因转染等细胞和分子生物学技术进行了功能分析和验证。同时，对ALDH2基因多态性与长寿的相关性进行了研究。第一部分不同发育阶段SD大鼠心肌线粒体的比较蛋白质组学分析目的：建立并优化心肌线粒体蛋白质组研究的双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)技术平台；筛查心肌线粒体中与衰老相关的蛋白质。方法：将清洁级雄性SD大鼠随机分为新生(2天)、成年(10周)、老年(12月)三组，提取心肌线粒体，抽提线粒体全蛋白质行2-DE，对样品制备、上样量、电泳参数、不同固定方式、不同染色方法、不同裂解液等相关技术进行了优化。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)鉴定图像分析出的差异蛋白点，同时进行了心肌组织ATP含量的检测。结果：45％乙醇5％乙酸的固定液对蛋白质固定效果最好；胶体考染和快速银染都是较理想的染色方法；含9M尿素的裂解液抽提蛋白，2-DE图谱所得蛋白点最多；构建了心肌线粒体具有高度分辨率和高度重复性的2-DE图谱。图像分析示2-DE凝胶有1100个蛋白点，84个心肌线粒体蛋白表达发生改变，质谱鉴定了43个差异点。差异蛋白多和呼吸链功能，能量代谢，物质运输和应激反应有关。新生期心肌组织ATP含量最低(15.49±1.33.g ATP／g心肌)，老年期心肌组织ATP含量较成年期下降(41.48±2.99 vs 59.64±2.68.gATP／g心肌，p＜0.01)。能量代谢的生化检测进一步证实了蛋白质组学的结果．结论：建立了SD大鼠心肌线粒体蛋白质组的2-DE分析技术。通过具有高度分辨率和高度重复性的2-DE图谱鉴定了SD大鼠心肌线粒体中在老年期差异表达的蛋白质，这些差异蛋白为深入理解衰老的分子机制提供了有益的线索。第二部分差异蛋白乙醛脱氢酶2的再验证及其对人胚肺成纤维细胞衰老进程的影响目的：为保证差异蛋白初筛结果的可信及下游分析的确定性，首先对差异蛋白ALDH2进行再验证，并探讨ALDH2在人胚肺二倍体成纤维细胞(MRC-5)衰老进程中的作用。方法：应用Western blot，RT-PCR检测不同发育阶段心肌线粒体中ALDH2在蛋白、mRNA水平的表达情况。通过构建腺病毒载体，使用含有ALDH2基因的腺病毒液将ALDH2基因导入MRC-5细胞中，并获得表达，通过检测衰老相关的。—半乳糖苷酶染色(senescence-associated—.—qalactosidae staining，SA—．—gal staining)、细胞内ROS水平和细胞周期观察其对MRC-5细胞衰老的影响。结果：Western blot，RT-PCR证实ALDH2的确在老年大鼠心肌线粒体中低表达。与对照组细胞相比，ALDH2基因导入后，MRC-5细胞的SA—.—gal染色阳性率下降，ROS水平较对照组下降(p＜0.01)。细胞周期未见明显改变。结论：ALDH2能延缓MRC-5细胞衰老的进程。第三部分ALDH2基因多态性与长寿的相关性研究目的：分析ALDH2在长寿人群中的基因型分布频率，进而探索ALDH2基因多态性和长寿的关系。方法：在山东省章丘市采集397名长寿老人和有非长寿家族史的161名60—75岁的对照组老人进行流行病学调查研究，并应用变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)技术检测研究对象的ALDH2基因型。结果：长寿组ALDH2~*1／ALDH2~*1、ALDH2~*1／ALDH2~*2和ALDH2~*2／ALDH2~*2三种基因型频率分别为65.7％，32.7％，1.5％。长寿组ALDH2~*1和ALDH2~*2等位基因的频率分别为82.12％和17.88％。长寿组基因型和等位基因的频率与对照组比较，均有显著性差异(p=0.001)。结论：ALDH2基因多态性与长寿现象有关联。结论1．建立了稳定，标准，适合自己实验室特点的2-DE技术平台。通过对2-DE相关技术的摸索和优化，发现并证实(1)胶体考染法和快速银染法均为较理想的染色方法；(2)45％乙醇5％乙酸的固定液对蛋白质固定效果最好，建议用于2-DE染色显示；(3)不同裂解液对最终蛋白斑点数影响较大。含9M尿素的裂解液处理线粒体获得蛋白斑点数最多。2．通过对不同发育阶段心肌线粒体的全蛋白质图谱进行比较，鉴定出43种差异显著蛋白，推测衰老与线粒体内多种差异蛋白相关。其中部分差异蛋白如ALDH2在老年期表达下降为最新报道。3．ALDH2基因的腺病毒液转染MRC-5细胞后，与对照组比较，SA—.—gal染色阳性率下降，细胞内ROS水平也下降。推测ALDH2能延缓MRC-5细胞衰老的进程。4．ALDH2基因多态性与长寿现象有关联。潜在价值和创新点1．我们首次通过比较蛋白质组学技术发现ALDH2在衰老时表达下调，并初步证实其具有延缓衰老的作用。2．通过对ALDH2的功能解析，首次发现ALDH2基因多态性与长寿现象有关联。该基因有可能成为延缓衰老的靶标。