大黄鱼三种凝集素的克隆表达、进化分析和功能研究

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大黄鱼(Pseudosciana crocea)是我国特有的经济鱼种,但养殖病害问题已成为制约大黄鱼养殖业持续稳定发展的主要因素。开展大黄鱼免疫的分子基础研究,明确免疫相关基因的分子特征及功能,可以深化以鱼类为代表的低等脊椎动物免疫系统的认识,也可为大黄鱼病害防治提供重要的理论依据。凝集素是一类重要的免疫因子,在免疫反应过程中发挥重要的作用,本论文利用一系列的生物化学和分子生物学方法,克隆鉴定了大黄鱼三种凝集素:C型凝集素LycDC-SIGN-like,F型凝集素LycFuco,B型凝集素LycLily,并研究了这三种凝集素在大黄鱼先天免疫防御中的作用。   DC-SIGN是一种C型凝集素,可介导DC(dendritic cells)细胞的迁移,抗原呈递,及T细胞的激活等,也是特定的病毒或者癌细胞逃脱免疫监视和免疫抑制的靶分子。本研究克隆了LycDC-SIGN-like cDNA,成熟肽为一种跨膜蛋白,胞外结构域含有一个保守的糖类识别结构域(carbohydrate recognition domain)及酪氨酸激活的免疫受体结构域(immunoreceptor tyrosine-based activation motif),胞内缺乏重复的颈结构域。LycDC-SIGN-like基因组全长2326bp,含5个外显子和4个内含子。LycDC-SIGN-like基因在鳃、肠、肝、肾、心、脾、肌、血八种组织中呈组成型表达,在肝脏、心脏和肌肉中的基因转录水平较高,在肾脏、脾脏、血液中较低。Poly I∶C和细菌三联疫苗刺激后,肾脏和脾脏组织中LycDC-SIGN-like的表达量均上调,表明其参与了这两种病原分子诱导的免疫反应。LycDC-SIGN-like重组蛋白凝集活性检测结果显示,该蛋白凝集兔血细胞的能力最强,凝集大鼠和小鼠血细胞能力相对较弱,不能凝集人和罗非鱼的血细胞,糖抑制试验结果表明,EPD基序决定了LycDC-SIGN-like特异性结合半乳糖的能力。该蛋白还可以凝集蜡样芽胞杆菌和大肠杆菌。实验结果为研究DC-SIGN分子在低等脊椎动物中的进化分析及生化机制提供了依据。   Fucolectin是一种可以特异性结合Fucose并且具有特征性结构域FTP的凝集素,在脊椎动物和无脊椎动物中已经被证实为一种免疫识别分子。目前研究认为单结构域的Fucolectin存在于较原始的硬骨鱼中,而多结构域的则存在于现代的硬骨鱼中。本研究通过RACEPCR技术克隆了两种Fucolectin(LycFuco-1,LycFuco-2)的全长cDNA和基因组序列。其中LycFuco-1含有两个FA58C(coagulation factor5/8 c-terminal domain)结构域,LycFuco-2只有一个FA58C(coagulation factor5/8 c-terminal domain)结构域,并进一步通过western blot技术验证了两种Fucolectin在大黄鱼脾脏和肾脏中的分布。LycFuco-1和LycFuco-2的基因组全长分别为3471bp和1921bp。本研究是第一次证实在大黄鱼这种现代硬骨鱼中,同时存在单结构域和双结构域的Fucolectin。模拟了两种大黄鱼Fucolectin的三维结构,并于striped bass的Fucolectin结构进行了比较分析。   通过大黄鱼转录组文库分析,发现了一个与鱼类、植物和细菌mannose specificlectin有很高同源性的片段,通过RACR PCR技术获得了该基因(LycLily)的cDNA序列,全长610bp,编码一个116aa的蛋白,分子质量约为12.76KDa。LycLily含有一个B-lectin结构域及三个保守的甘露糖结合结构域(QXDXNXVXY),基因组全长987bp,与Leiognathus nuchalis中的mannose-binding lectin有70%的同源性,为一种皮肤粘液蛋白。LycLily基因在鳃、肠、肝、肾、心、脾、肌、血八种组织中呈组成型表达,并且在鳃、皮肤、肌肉中的表达水平最高。Poly(I∶C)或三联菌苗诱导下,LycLily表达显著上调,说明LycLily可能在炎症反应中有重要作用。检测了LycLily的生物学活性,发现其不能凝集九种受试菌,不能与LPS和LTA结合,也不能凝集石斑鱼肾脏细胞和草鱼的肾脏细胞。该凝集素的免疫相关功能还有待进一步深入研究。
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