磷脂酶 A2是一类可催化细胞膜和脂蛋白磷脂二位酰基（Sn-2）水解，释放溶血磷脂及游离脂肪酸的酶族，从而参与人体花生四烯酸通路，进一步的产生大量的炎症因子，造成机体损伤。磷脂酶 A2在生物个体中分布广泛，在多种蛇类蛇毒中已发现多种类型的PLA2，含量丰富，毒性多样，表现出细胞毒性、神经毒性、肌肉毒性以及出血毒性等多种毒性，可以作为开发抗蛇毒药物的关键靶点。据研究发现，一些种类的蛇的肝脏可以表达一种蛋白质，可以特异性中和蛇毒组分 PLA2，从而保护自己不被自身毒液所伤害，这种蛋白称为 PLA2抑制剂（ phospholipase A2 inhibitors, PLI）。实验室前期研究中，我们从中华水蛇血清中纯化得到一个新PLIγ，它对五步蛇svPLA2酶活性和出血毒均有强抑制效果。由于蛇资源缺乏且血量较少，从中提取大量 PLI较为困难，实验室前期构建中华水蛇PLIγ原核表达系统，但蛋白以没有生物活性的包涵体形式存在，复性效率低，对其酶活有所影响，故将采用真核表达方式得到中华水蛇PLIγ。　　目的：　　为更加方便快捷的得到活性更高的中华水蛇PLIγ蛋白，构建pPICZαA-PLIγ重组表达载体，转化进毕赤酵母中进行真核表达，进一步的进行活性测定，为开发新型抗蛇毒药物奠定基础。　　方法：　　采用琼脂糖活性平板实验，根据形成透明圈的面积，检测中华水蛇血清PLIγ对3种蛇毒酶活的抑制活性；分别向小鼠皮下注射3种蛇毒粗毒，造成小鼠皮下出血形成血斑，注射天然血清与蛇毒混合溶液，比较出血斑的大小，从而证明中华水蛇天然PLIγ的广谱抗蛇毒作用。　　设计分别带有EcoR I和Not I酶切位点的上下游引物，对实验室前期构建的原核表达载体pET28c(+)-PLIγ进行扩增，从而得到全长为570 bp的PLIγ基因，经双酶切之后，连接至酵母表达载体pPICZαA上，转化至DH5α中进行扩增。设置参数1.5 KV，25μF，电转时间5 ms，将线性化后pPICZαA-PLIγ重组质粒，电转化至毕赤酵母 GS115中，利用博来霉素筛选阳性克隆。提取阳性克隆酵母DNA，利用PCR进行鉴定。在30℃、250 rpm条件下，使用终浓度0.5％甲醇对筛选的转化子进行诱导，连续培养120 h，每隔24 h收集发酵液上清， western bolt使用anti-His抗体检测目的蛋白PLIγ表达效果，确定最佳诱导时间。　　采用镍柱亲和层析分离纯化 PLIγ，SDS-PAGE检测纯度。使用琼脂糖平板法检测PLIγ对五步蛇毒粗毒酶活的抑制作用，测量透明圈直径，计算抑制率。利用小鼠皮下注射实验，对比血斑面积，检测PLIγ对五步蛇粗毒的出血毒性抑制效果。　　结果：　　在针对五步蛇毒和蝮蛇蛇毒的琼脂糖平板实验中，中华水蛇PLIγ实验组透明圈直径减小。在眼镜蛇粗毒组，中华水蛇PLIγ实验组与阳性对照组相比，透明圈直径无明显变化。在小鼠皮下注射实验中，注射中华水蛇PLIγ蛋白致使五步蛇毒和蝮蛇毒的造成的出血斑的面积减小。在眼镜蛇毒组，注射中华水蛇PLIγ蛋白使小鼠的存活时间延长0.5-1 h。　　成功从pET28c(+)-PLIγ质粒克隆得到目的基因，长度为570 bp，并经过双酶切构建pPICZαA-PLIγ重组质粒，经过测序发现PLIγ基因没有发生任何突变。重组质粒经ScaI酶线性化，成功电转至酵母GS115细胞中，在含博来霉素平板上长出菌落，PCR鉴定其为阳性转化子。甲醇诱导，取发酵液上清，通过western bolt检测到目的蛋白PLIγ的表达，在23 kDa左右处出现条带，并在培养时间为72 h时蛋白表达量最多。发酵液经亲和层析分离纯化后，SDS-PAGE检测得到单一PLIγ蛋白条带。琼脂糖活性平板实验中，PLIγ使透明圈面积减小，对五步蛇毒酶活的抑制效率为84%。五步蛇毒小鼠背部出血试验中， PLIγ显著改善血管破损症状，出血斑面积减小。　　结论：　　中华水蛇PLIγ对蛇毒粗毒的酶活性和出血毒性、神经毒性有较好抑制效果，具有广谱抗蛇毒作用。pPICZαA-PLIγ重组质粒在酵母GS115细胞中，可被甲醇诱导产生PLIγ蛋白，且对五步蛇毒的酶活及出血毒性表现出较好的抑制作用，但发酵条件有待进一步优化。