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目的:Heymann肾炎是人类特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)的经典动物肾炎模型,具有人类特发性膜性肾病的临床及病理特点。近些年的研究结果显示Heymann肾炎发病机制涉及补体活化、氧化反应、细胞因子激活、内质网应激和自噬等个多方面。在Heymann肾炎发病过程中,补体活化后产生膜攻击复合物C5b-9,可诱导生成大量的活性氧。大量动物实验证实,活性氧的堆积可激活Nrf2/HO-1信号通路,发挥抗氧化应激作用,从而阻止脂质过氧化反应的发生。此外,在Heymann肾炎后期,主要的病理改变是Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白等细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分增多堆积。研究证实转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可以促进ECM的形成,在肾小球硬化及纤维化机制中占有重要地位。这样,氧化反应与炎症因子协调作用,共同导致了肾脏组织病变。探索新型的治疗方法,阻断或抑制氧化和炎症反应,延缓肾功能损害,一直都是肾脏病领域研究的热点。早些年,国内外学者一直认为氢气属于生理性惰性气体。随着研究的深入,越来越多的证据显示氢气具有选择性抗氧化、抗炎及抗凋亡的作用,但与肾脏病相关的研究报道甚少。本课题拟通过建立主动型Heymann肾炎(Active Heymann Nephritis,AHN)大鼠模型,应用免疫组织化学染色、实时定量PCR等方法检测肾脏组织中Nrf2、HO-1及TGF-β1、Ⅳ型胶原的表达情况。并给予富氢液(15mg/Kg)进行干预,观察AHN大鼠肾脏组织内各指标的表达状况,探讨富氢液对其干预作用及机制,为人类IMN的预防和治疗提供新的思路。方法:选择SD大鼠(健康清洁级,雄性)36只,体重约200±20g,随机分为正常对照(NC组,n=12)、Heymann肾炎模型组(HN组,n=12)、富氢液干预组(HRS组,n=12)。适应性喂养1周后,给予HN组、HRS组大鼠腹腔注射免疫原2ml/只(含肾皮质0.5g),制备Heymann肾炎大鼠模型;NC组大鼠给予腹腔注射佐剂对照2ml/只,作为正常对照;腹腔注射方式均为每两周一次,共6次。自注射免疫原第一次起,HRS组大鼠每日给予(浓度0.8 mmol/L)富氢液15ml/kg灌胃,NC组、HN组则每日给予等量的生理盐水灌胃。实验期间,所有大鼠均饲养于温度(20℃-26℃)且湿度(45%-70%)的相对恒定的环境中,自由进食水。于4周末、8周末,将大鼠置于清洁代谢笼内,留取24小时尿并测定24小时尿蛋白定量。大鼠在注射免疫原后4周末,高于正常大鼠24小时尿蛋白定量则为肾炎形成的标志。至第一次注射免疫原后12周末、14周末,每组随机选取6只大鼠,测定24小时尿蛋白定量、血肌酐、血尿素氮。并收集大鼠肾组织标本,制备病理组织切片,以备苏木素-伊红(HE)染色、糖原(PAS)染色及免疫组织化学染色,观察大鼠肾组织病理变化;免疫组织化学及实时定量PCR方法检测Nrf2、HO-1及TGF-β1、Ⅳ型胶原的表达情况。实验所得数据用均数±标准差((?)±S)表示,应用SPSS 20.0统计分析软件对数据进行处理,满足正态性和方差齐性检验的数据采用单因素方差分析,不满足正态性和方差齐性检验的数据资料采用非参数检验分析,P<0.05有统计学意义。结果:1一般情况NC组大鼠饮食正常,毛发光亮柔顺,生长发育良好。HN组、HRS组大鼠腹腔注射免疫原后逐渐出现饮食减少,反应迟钝,毛发无光,部分大鼠出现腹水。其中HRS大鼠较HN组大鼠情况稍好。2生化指标2.1 24小时尿蛋白定量与同期NC组相比,所有时间点中,HN组、HRS组大鼠24小时尿蛋白水平均升高(P<0.05)。其中,与HN组相比,4周末,HRS组大鼠24小时尿蛋白水平无明显变化(P>0.05);8周末、12周末、14周末,HRS组大鼠24小时尿蛋白水平显著下降(P<0.05)。2.2血肌酐、血尿素氮与同期NC组相比,12周末、14周末,HN组、HRS组大鼠血肌酐、血尿素氮水平升高(P<0.05)。与HN组相比,12周末,HRS组血肌酐水平未见明显变化(P>0.05),而血尿素氮水平出现下降(P<0.05);14周末,HRS组血肌酐、血尿素氮水平均出现明显下降(P<0.05)。3肾脏组织变化光镜下显示,NC组大鼠肾组织结构正常,基底膜均匀一致,无增厚,无系膜细胞、系膜基质增多等异常改变。与NC组相比,HN组和HRS大鼠肾小球基底膜呈不同程度增厚,内皮细胞胞质肿胀;肾小管结构紊乱,间质内有局灶性淋巴细胞及浆细胞浸润。且HN组较HRS组肾脏组织病变更加严重,14周末较12周末病理改变更明显。4免疫组织化学检测与同期NC组相比,12周末、14周末时,HRS组、HN组Nrf2、HO-1、TGF-β1、Ⅳ型胶原表达均增多(P<0.05);与同期HN组相比,HRS组TGF-β1、Ⅳ型胶原表达水平下降(P<0.05),Nrf2、HO-1表达有所增多(P<0.05)。5实时定量PCR检测与同期NC组相比,12周末、14周末时,HRS组、HN组Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、TGF-β1 mRNA、Ⅳ型胶原mRNA表达均增多(P<0.05);与同期HN组相比,HRS组TGF-β1 mRNA、Ⅳ型胶原mRNA表达水平不同程度下降(P<0.05),而Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表达有所增多(P<0.05)。结论:1 HN组大鼠肾脏组织中,Nrf2、HO-1抗氧化应激通路蛋白表达增加,且TGF-β1、Ⅳ型胶原表达升高,表明有氧化应激与纤维化存在。2富氢液可上调Nrf2、HO-1的水平,并减少TGF-β1、Ⅳ型胶原的表达,从而减轻肾脏组织氧化应激损伤,延缓肾脏纤维化,具有一定的肾脏保护作用。