论文部分内容阅读
本研究系统地进行了vip3A基因的PCR-RFLP（多聚酶链反应-限制性片段长度多态性）鉴定,目前,国内外还未见正式报道。通过此方法对实验室保存的606株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt.）菌株的vip3A（营养期杀虫蛋白;VIP）基因型进行了鉴定;对BtAL和Bt41两Bt菌株所含的cry和vip3A基因型进行了鉴定;完成了菌株BtAL vip3A基因的克隆、表达及对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、棉铃虫（Helicoverpa armigera）、小菜蛾（Plutella xylostella）和玉米螟（Ostrinia furnacalis）幼虫的生物活性测定;并克隆得到Bt41中vip3A的基因片段。 本研究建立了PCR-RFLP的方法,筛选vip3A基因。此方法根据五种vip3A基因的保守区设计一对通用引物,用来扩增vip3A基因的1,456 bps的基因片段,此片段经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后,电泳检测酶切条带大小,根据电泳图谱,确定基因类型。通过此方法,从鉴定的606株Bt菌株中有382株得到vip3A基因扩增产物,约占总数的63%,说明vip3A基因的分布广泛。根据酶切电泳显示,共有三种RFLP图谱,315株含有与已知vip3Aa1相同的电泳图谱（860,260,190和160 bps）,另外发现两种新的RFLP图谱与已知5种基因不同,其中52株（含菌株BtAL）的电泳图谱显示860,260,160,150 bps条带;15株（含菌株Bt41）的电泳图谱显示1,100,190和160 bps,均不同于其他已知vip3A的RFLP图谱。 对含有新vip3A基因的BtAL菌株质粒DNA进行cry和vip3A基因鉴定,发现其含有cry1Ab,cry1Ca,cry1Cb,cry1Fb,cry1Bd,cry1Ib,cry2Ab,cry9Eb和新型vip3A基因。以BtAL菌株质粒DNA为模板扩增得到2.37 kb vip3A基因产物,插入到表达载体pET-21b上,得到重组质粒pBvip,完成克隆和测序,并将序列提交GenBank登记,Accession number为DQ241674,Bacillus thuringiensis杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Vip3Aa19。序列分析表明Vip3Aa19蛋白由789个氨基酸组成,分子量为88.7kDa,该蛋白等电点为pH5.17,为弱酸性蛋白。与所有的Vip3类蛋白作了同源关系分析,此蛋白与已知Vip3Aa12具有最高为97.6%的序列同源性,存在19个氨基酸残基的不同。将含有pBvip质粒的大肠杆菌在0.7mmol/L IPTG,18℃,130r/min条件下,诱导表达18小时,提取表达产物,SDS-PAGE分析表明vip3Aa19基因在E.coli中表达蛋白为可溶的。生物活性测定表明表达产物对甜菜夜蛾幼虫具有显著的杀虫活性,LC50为1.43ng/mg饲料;对棉铃虫和小菜蛾幼虫也具有显著的杀虫活性,LC50分别为24.14 ng/mg饲料和59.82 μg/mL;但此蛋白对玉米螟活性不高,LC50大于100μg/mL,只具有一定的体重抑制作用。 对含有新vip3A基因的Bt41菌株质粒DNA进行cry和vip3A基因鉴定,发现菌株Bt41含有cry1Aa,cry1Cb,cry1Ie和一种新型vip3A基因。并从Bt41菌株中克隆得到了vip3A的基因片段1,456 bps,测序结果显示其蛋白序列与已知Vip3Af1具有83%的序列同源性。在GenBank登记,Accession number为DQ250256。 本研究发现了两种新的vip3A新基因,完成了vip3Aa19基因的克隆及活性测定,确定了对鳞翅目昆虫甜菜夜蛾的高毒力。由于甜菜夜蛾是一类危害极其严重、抗性上