孤啡肽受体(Orphan opioid-like receptor.ORL-1)是近年来新发现的一种内源性阿片肽受体,广泛分布于中枢和外周组织,参与机体的多种生理活动。孤啡肽(orphanin-FQ,OFQ)是目前发现的孤啡肽受体唯一的内源性配基,在机体中发挥着重要的功能。文献显示,机体在脑缺血再灌注后孤啡肽(OFQ)的含量有明显的升高,并通过其受体ORL-1抑制缺血再灌注后局部脑神经元的兴奋性,且对局部神经元递质的释放、局部的脑血流变化等均能产生明显的影响。据此,有学者推测OFQ/ORL1系统可能在缺血性脑损伤中发挥着重要的作用。本实验在SD大鼠局灶性脑缺血模型(MCAO)的基础上,通过侧脑室给药的方法,观察了不同剂量及不同时间点给予孤啡肽受体阻断剂(Nphe)对局灶性脑缺血神经元损伤的影响,初步探讨了OFQ/ORL1系统在缺血再灌注神经元损伤中的保护作用及其可能的机制,为进一步研究奠定了基础。实验一不同剂量的Nphe预处理对局灶性脑缺血神经元损伤的保护作用目的:研究给予不同剂量的孤啡肽受体阻断剂Nphe预处理对局灶性脑缺血神经元损伤的保护作用。方法:体重280-320g的雄性SD大鼠78只,随机分为假手术组(S组)、对照组(C组)和四个不同剂量的给药组(T0.03、T0.3、T3、T30),每组大鼠13只,其中每组大鼠随机分为两部分,其中10只在缺血再灌注后24h行神经功能学评分(NDS评分)和脑梗死容积的测量,余下3只在缺血再灌注后24h断头处死,Western-Blot检测caspase-3在海马和纹状体的表达。C和T组均采用线栓法阻断大脑中动脉实验动物模型(MCAO),缺血2h后恢复再灌注,S组完成与C组相同的手术操作但不置入尼龙线,T组分别于术前45min右侧脑室注射孤啡肽受体阻断剂Nphe 0.03nmol、0.3nmol、3nmol和30nmol/ 10ul,S组和C组于手术前相同时间点侧脑室给予相同容量的生理盐水。结果:NDS评分缺血再灌注后24h神经功能学评分结果显示:S组动物的NDS评分正常,C组和T0.03组大鼠NDS评分显著下降,二组间无明显差异(P >0.05);T0.3、T3和T30组大鼠的NDS评分明显提高,与C组比较均有统计学意义(P<0.05),其中T3组和T30效果更为明显,T3、T30与T0.3组比较差异有统计学意义(P<0.05)。脑梗死容积S组未见梗死,C组(40.23±7.25%)和T0.03组(39.88±5.55%)梗死面积明显高于T0.3组(28.47±5.89%)、T3组(21.08±5.71%)和T30组(19.98±5.27%),差异有统计学意义(P<0.05)。表明侧脑室给予0.3nmol、3nmol和30nmol的孤啡肽受体阻断剂Nphe能够减轻缺血再灌注后的神经元损伤,其中T3和T30组的效果更为明显,但二组之间并无统计学差异(P >0.05),此与行为学评分的结果比较相一致。Western-blot结果显示:脑缺血再灌注24h后,C组和T0.03组大鼠海马和纹状体组织Caspase-3蛋白的表达较其它各组显著升高,T0.3、T3和T30组大鼠的Caspase-3表达虽明显受到抑制,但仍明显高于S组。实验二不同时间点给予Nphe对缺血再灌注大脑神经元损伤的保护作用目的:研究在缺血或缺血再灌注后不同时间点给予孤啡肽受体阻断剂Nphe对神经元损伤的影响方法:体重280-320g的雄性SD大鼠45只,采用线栓法阻断大脑中动脉实验动物模型(MCAO),随机分为对照组(C组)和4个处理组(T组),处理组于缺血后1h(T1h组)、再灌注后1h(T1H组)、4h(T4H组)、12h(T12H组)四个时间点侧脑室给予孤啡肽受体阻断剂(Nphe)3nmol/ 10ul,各组均于缺血2h后恢复再灌注。所有组别大鼠随机分为两部分,6只在恢复再灌注后24h时,完成行为学评分后断头处死并计算脑梗死容积;其余3只在再灌注后24h断头处死,0℃下分离纹状体组织,Western-Blot半定量分析Caspase-3蛋白的表达。结果:NDS评分与对照C组相比,缺血再灌注后24小时,T1h、T1H组的行为学评分明显提高,统计学差异明显(P < 0.05);T4H组评分较C组有所提高,但组间比较无统计学意义(P >0.05);T12H组与C组相比无明显统计学差异(P >0.05)。脑梗死容积T1h组(26.32±6.75%)、T1H组(30.38±6.06%)的梗死容积明显小于C组(42.22±8.29%),有统计学差异(P < 0.05)。T4H组(36.00±9.60%)和T12H组(39.79±8.40%)的梗死容积较C组有所减小,但统计分析无差异(P >0.05)。Western-Blot结果显示:缺血再灌注24小时后, T1h、T1H组的Caspase-3蛋白的表达较C组明显受到抑制,且明显低于T4H、T12H组。结论1.预处理给予不同剂量的Nphe能够明显减轻缺血再灌注后的神经元损伤,发挥缺血再灌注后的神经元保护作用,且存在一定的剂量效应。2. Nphe对缺血后神经元的保护和治疗作用存在着一定的时间依从性;给予有效剂量Nphe的预防效果优于治疗作用。3. Nphe可以明显抑制缺血再灌注后凋亡蛋白的产生,表明其对缺血性神经元损伤的保护作用可能是通过抑制凋亡的途径来实现的。