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南蛇藤(Celastrus oricultus Thunb.)系卫矛科南蛇藤属植物,始载于清代《植物名实图考》,在我国分布较为广泛,又名过山风、降龙草、黄藤等。主要有抗炎镇痛、行气活血、消肿、祛风解毒等作用。现代药理学研究发现南蛇藤具有抑制肿瘤细胞的增殖以及侵袭转移、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成等生物学活性。胃癌严重危害着人类的健康,发病率和死亡率高,预后差。胃癌是全球最常见的消化道肿瘤之一,每年约有70万人死于胃癌,该人数占消化系统肿瘤总死亡人数的一半以上,临床上治疗胃癌常以外科手术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、中医中药辅助治疗为主。但由于胃癌患者早期诊治率较低,同时胃癌细胞的侵袭转移能力较强,容易复发转移,因此患者的预后往往都比较差。因此,探索胃癌侵袭和转移的相关机制,发现胃癌的治疗靶点,对胃癌的诊治及预防复发转移均有重大意义。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)在胃癌细胞中的表达水平异常增高,是胃癌细胞增殖和侵袭转移的关键分子。上皮间质转化过程(epithelial mesenchymaltransition,EMT)是胃癌细胞向淋巴结转移的重要步骤。因此,EMT也是胃癌侵袭转移机制的研究热点。除此之外,EMT的异常活化,还增加胃癌细胞对常用化疗药物顺铂的耐药性。本课题组前期研究发现,南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus Extracts,COE)明显抑制胃癌细胞的增殖,但具体作用机制并不明确。本研究,构建了消减表达mTOR分子的人胃癌MGC-803细胞,研究了南蛇藤提取物靶向mTOR抑制胃癌细胞的侵袭转移的分子机制。本次研究内容共分为三部分:第一部分人胃癌组织mTOR的表达以及人胃癌MGC-803/mTOR细胞的构建目的:观察人胃癌组织样本中mTOR信号转导通路相关蛋白的表达。构建消减mTOR表达的人胃癌MGC-803细胞模型。方法:免疫组化法检测人胃癌组织样本中mTOR、p-mTOR蛋白及上皮间质转化相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)的表达水平。对数期人胃癌MGC-803细胞,利用慢病毒感染技术,将含有mTOR siRNA的重组基因整合至MGC-803细胞DNA,使胃癌细胞MGC-803中mTOR的表达量消减。慢病毒感染24 h后,倒置荧光显微镜下观察细胞的荧光强度,Western blot免疫印迹法检测细胞中mTOR蛋白的表达水平。结果:免疫组化结果显示,与邻近正常胃组织相比,胃癌组织中mTOR和p-mTOR蛋白的表达量明显升高。检测上皮间质转化相关蛋白的结果表明,胃癌组织中E-cadherin的表达量降低,而N-cadherin和Vimentin的表达水平明显升高。慢病毒感染人胃癌MGC-803细胞24h后,于倒置显微镜下观察到明显的荧光强度。Western blot结果显示,与野生型细胞相比,感染慢病毒后的人胃癌MGC-803细胞中,mTOR的蛋白表达水平明显降低(P<0.001)。结论:胃癌组织样本中,mTOR、p-mTOR的表达量明显升高,胃癌细胞中存在着上皮间质转化现象。消减表达mTOR的人胃癌MGC-803/mTOR-细胞构建成功。第二部分南蛇藤提取物对人胃癌MGC-803/mTOR-细胞增殖和侵袭转移能力的影响目的:利用消减表达mTOR的人胃癌MGC-803/mTOR-细胞模型,探究南蛇藤提取物对该细胞增殖和侵袭转移能力的影响。方法:对数期人胃癌MGC-803/mTOR-细胞,加入不同浓度的南蛇藤提取物(10,20,40,80,160,320 μg/mL)分别作用24h、48h和72h后,用MTT 比色法观察药物对MGC-803/mTOR-细胞增殖能力的影响,根据IC50值,确定后续实验COE的用药浓度。同时设立野生型细胞组、不加药阴性对照组和阳性对照组(5-Fu,50μg/mL)。药物作用24h后,划痕实验检测药物对细胞移行能力的影响,Transwell小室实验检测药物对细胞侵袭和转移能力的影响。结果:药物作用24h、48h和72h后,均能抑制人胃癌MGC-803/mTOR-细胞的增殖,且具有一定的时间和剂量依赖性(P<0.05)。经计算,药物作用24h的IC50值约为129.17μg/mL,为了避免药物的细胞毒作用对实验结果的影响,确定后续实验的COE使用浓度为20μg/mL、40μg/mL和80μg/mL。药物作用24h后,与对照组相比,人胃癌MGC-803/mTOR-细胞的侵袭迁移能力明显降低,并呈一定的浓度依赖性(P<0.05)。结论:COE明显抑制人胃癌MGC-803/mTOR细胞的增殖和侵袭迁移能力。第三部分南蛇藤提取物抑制人胃癌MGC-803/mTOR-细胞侵袭转移的分子机制目的:研究COE对人胃癌MGC-803/mTOR细胞中EMT相关蛋白和PI3K/Akt/mTOR信号转导通路的影响,初步探讨COE抑制胃癌细胞侵袭转移的分子机制。方法:对数期人胃癌MGC-803/mTOR-细胞,分为COE作用组(20μg/mL、40μg/mL和80μg/mL),阴性药物对照组(不加药),阳性药物对照组(5-Fu,50μg/mL),同时设置野生型细胞对照组。药物作用24h后,提取细胞总蛋白,Western blot检测EMT相关蛋白(包括 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)和 mTOR 信号通路相关蛋白(包括 mTOR、p-mTOR、P70S6k、p-P70S6k、4EBP1、p-4EBP1、PI3K 和 Akt)的表达水平。结果:COE 显著降低 N-cadherin、Vimentin、mTOR、p-mTOR、P70S6k、p-P70S6k、4EBP1、p-4EBP1、PI3K和Akt蛋白的表达水平,呈浓度依赖性(P<0.05);随着COE浓度的递增,E-cadherin蛋白的表达量增加(P<0.05)。结论:COE抑制人胃癌MGC-803/mTOR-细胞的侵袭转移,其机制可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。