研究背景:在我国结直肠癌(CRC)足常见的恶性肿瘤之一，目前居恶性肿瘤发病率的第4位。近年来发病率逐渐上升，且有年轻化的趋势，在大城市的发病率已居恶性肿瘤的第三位。结直肠癌是导致肿瘤相关死亡的第二大原因。手术治疗是大肠癌最有效的治疗手段。化疗和放疗则是对手术治疗的一个很好的补充。然而到目前为止，结直肠癌的发生发展机制仍未清楚。对大肠癌的治疗仍存在一些问题：尽管80％的结直肠癌患者在术后未被证实有残留病灶，但仍有30％～40％的患者复发，最终死于随后的肿瘤转移[1]；化疗是结直肠癌除手术外的另一有效治疗方法，但80％～90％的结直肠癌为分化型腺癌，增殖缓慢，对化疗的敏感性差，容易产生耐药，同时化疗的毒副作用多。目前人们对以上问题仍感十分棘手，同时对此尚缺乏一些有预见性的指标。因此，从分子水平上揭示基因变化，阐明结直肠癌发病机制，同时努力发掘一些分子生物学指标，作为结直肠癌的早期诊断和判断预后的预见性指标仍然是其研究重点。　　 大量实验证明结直肠癌的发生与多个癌基因的激活或抑癌基因的失活有关。Ras癌基因是其中之一。其家族由K-ras、H-ras和N-ras三个密切相关的成员组成。进一步研究发现在胰腺癌、胆管癌、结直肠癌和肺癌等中有高频率的K-ras基因点突变，但在不同的肿瘤中，突变程度不同；而且其绝大部分的点突变发生在其1号外显子第12和第13密码子上。野生型K-ras基因12位密码子编码的氨基酸为甘氨酸，突变型编码的氨基酸常为半胱氨酸、缬氨酸、精氨酸等，由于突变导致其编码的氨基酸发生改变，从而产生具有致癌活性的p21蛋白。传统的基因突变检测方法，大多需要利用琼脂糖凝胶电泳或聚苯烯凝胶电泳来分离野生型DNA分子和突变型DNA分子，操作复杂，费时费力，需要使用放射性元素或溴化乙锭等有害物质，且不符合自动化分析的要求，具有一定的局限性。本研究分三部分，第一部分采用近年发腱起来的实时荧光定量PCR和基因测序技术检测结直肠癌组织中K-ras基因的第12和第13密码子突变情况，探讨K-ras基因突变与结直肠癌生物学行为的关系。第二部分采用实时荧光定量PCR和基因测序技术检测结直肠癌患者门静脉血液中K-ras基因突变情况，明确结直肠癌患者门静脉血液、肝转移灶是否和肿瘤组织一样，存在着K-ras基因的突变，揭示K-ras突变与结直肠癌肝转移的关系。第三部分在前两部分研究的基础上，联合检测肿瘤组织中K-ras基因突变情况和患者血清CEA水平，探讨二者联合检测对结直肠癌肝转移的预测作用。　　 第一部分 K-ras基因突变与结直肠癌生物学行为的关系　　 研究目的：观察结直肠癌组织中K-ras基因突变情况，探讨K-ras基因突变与结直肠癌生物学行为的关系。研究方法：采用实时荧光定量聚合酶链反应方法和基因测序技术检测123例结直肠癌组织中k-ras基因1号外显子12、13密码子突变情况，结合其临床病理资料分析。研究结果：123例结直肠癌组织中k-ras基因突变者53例(40.8％)，其中12密码子突变42例(34.1％)，13密码子突变者11例(8.9％)。基因突变率与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤侵润深度、分化程度无明显相关性，与淋巴结转移、肝脏转移及TNM分期有相关性。有淋巴结转移者k-ras基因突变率(63.8％)明显高于无淋巴结转移者(30.3％)，有肝脏转移者基因突变率(68.8％)明显高于无肝转移者(39.3％)，TNM分期III、IV期基因突变率(56％)明显高于I、II期(32.9％)。结论：K-ras基因突变在结直肠癌的发生、发展过程中起重要作用，而且与淋巴结转移和肝脏转移有密切相关，可作为判断结直肠癌恶性程度的一个分子生物学指标。　　 第二部分结直肠癌患者门静脉血K-ras基因突变　　 研究目的：通过检测结直肠癌患者门静脉血液中K-ras基因突变情况，以期明确结直肠癌患者门静脉血液、肝转移灶是否和肿瘤组织一样，存在着K-ras基因的突变，揭示K-ras突变与结直肠癌肝转移的关系。研究方法：采集25例结直肠癌患者门静脉血液、原发肿瘤组织、相应的癌旁肠黏膜以及肝转移灶组织，收集整理25例结直肠癌患者的临床随访资料，用实时荧光定量PCR技术和基因测序技术检测以上血液及组织标本中K-ras基因突变情况，并进行统计学分析。研究结果：25例结直肠癌患者中8例(32％)门静脉血中捡出K-ras基因突变，且突变均发生在12密码子上，突变类型为GGT突变为GAT和GGT突变为GTT，未发现13密码子的突变。25例肿瘤组织中9例(36％)发现K-ras基因突变，门静脉血和癌组织的基因突变率差异不明显。25例癌旁黏膜中2例(8％)捡出K-ras基因突变，明显低于癌组织的基因突变率。Duke's C和D期患者门静脉血K-ras基因突变率(54.5％)明显高于Duke's B期(14.3％)。8例门静脉血检测出K-ras基因突变者，其相应的肿瘤组织中均发现K-ras突变。而结直肠癌组织中无K-ras基因突变者，患者门静脉血及癌旁黏膜无1例检测出基因突变。3例同时性肝转移患者门静脉血均发现K-ras基因突变，且结直肠癌原发肿瘤组织K-ras基因突变与肝脏转移灶的K-ras基因突变一致。2例门静脉血检测到K-ras基因突变患者，手术时无肝转移，但分别于术后第6个月和第9个月经CT检查证实有肝转移。结论：结直肠癌患者门静脉血中可检测到K-ras基因突变，突变率(32％)与原发癌组织中检测到的(36％)相近。突变主要集中在K-ras基因的12密码子。门静脉血中K-ras基因突变阳性，则在原发癌组织中大多也可检测到K-ras基因突变；原发癌组织无K-ras基因突变，门静脉血中基本也检测不到基因突变。原发癌组织和门静脉血均有K-ras基因的突变，可能预示着肿瘤可能通过血行转移至肝脏或是肝脏有微转移。　　 第三部分癌组织K-ras基因突变和血清CEA的联合检测预测结直肠癌肝转移的意义　　 研究目的:观察结直肠癌组织中K-ras基因突变情况，同时检测患者外周血清CEA水平，探讨二者与结直肠癌肝转移的关系。研究方法采用实时荧光定量PCR方法和基因测序技术检测100例结直肠癌组织中k-ras基因1号外显子12、13密码子突变情况，采用化学发光法检测患者血清CEA水平，结合其临床资料分析。研究结果100例结直肠癌组织中39例(39.0％)捡出K-ras基因突变，其中12号密码子突变31例，13号密码子突变8例。在36例肝转移组(同时性肝转移16例，异时性肝转移20例)中，K-ras基因突变23例(23/36，63.9％)；在64例无肝转移组中，K-ras基因突变16例(16/64，25.0％)；23例突变者进行基因测序，突变位于12密码子者21例(GGT to GAT13例，GGT to GTT8例)，突变位于13密码子者2例(GGC to GAC)。36例有肝转移患者外周血清CEA水平为66.79±127.46ng/ml，其中25例(25/36，69.4％)出现不同程度CEA升高；64例无肝转移患者外周血清CEA水平为4.93±4.62ng/ml，其中24例(24/64，37.5％) CEA升高。两个指标联合检测，肝转移组的阳性率(22/36，61.1％)明显高于无肝转移组的阳性率(5/64，7.8％)。其预测结直肠癌肝转移的敏感性及特异性分别为61.1％和92.2％。结论K-ras基因突变、血清CEA水平与结直肠癌肝脏转移有密切相关，联合检测癌组织K-ras基因突变和血清CEA水平可预测结直肠癌肝转移。