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全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染者已超过3.5亿人，我国是HBV感染的高发区，HBV携带者高达10％～15％。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，HBV感染是引起肝癌的主要原因之一。流行病学调查显示，在HBV慢性感染者中，C基因型较B基因型更易导致肝癌的发生，但HBV不同基因型感染导致肝癌发生差异的原因尚不清楚，有待进一步阐明。
HBVX蛋白(HBx)是乙型肝炎病毒(HBV)X基因区编码的多肽，参与调控细胞周期和细胞凋亡，其抑制细胞凋亡的功能与HBV相关肝癌的形成及进展密切相关。细胞凋亡是由基因控制的自主有序的死亡过程，抑癌基因P53及其产物在调控细胞凋亡的过程中发挥促细胞凋亡的作用。P53蛋白病毒或细胞蛋白结合可抑制其促凋亡作用，从而引起细胞癌变，促进肿瘤的形成及发展。HBx蛋白与P53结合后，使细胞的凋亡受到抑制，促进肝癌的发生发展。阿霉素是一种临床上常用的抗肿瘤药物，他的主要作用是是诱导肿瘤细胞DNA损伤和干扰DNA的代谢，从而促进肿瘤细胞凋亡，其促凋亡作用受P53调控，HBx结合P53蛋白可抑制其诱导的细胞凋亡。
国内HBV感染常见者为B和C基因型。林旭等通过序列比对表明两基因型间X基因存在不同，其所编码的X蛋白间存在17个氨基酸差异，有人进行基因缺失研究表明HBx与P53结合区位于HBX—COOH末端102～136aa区域；HBVB、C基因型X蛋白在这一区域内有四个氨基酸差异，HBVB、C基因型X蛋白—COOH末端氨基酸的差异是否引起它们与P53蛋白相互作用的不同，从而导致两基因型HBx蛋白抑制细胞凋亡的差异，进而引起HBV基因型感染导致肝癌发生率差异尚不得而知。
研究目的：
以阿霉素诱导细胞凋亡作为模型，研究HBVB、C基因型HBx蛋白对肝癌细胞凋亡调控作用的差异，进而为阐明HBVB、C基因型导致肝癌发生率的差异提供理论依据。
实验方法：
采用巢氏PCR法对HBVDNA进行基因分型，以B、C基因型HBVDNA为模版，采用PCR法扩增B、C基因型HBVX基因片段，并定向插入绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pEGFP—C1的HindⅢ和KpnⅠ酶切位点，并用HindⅢ、KpnⅠ双酶切及测序鉴定以构建重组体pGFP—XB及pGFP—XC，使用FugeneHD将载体pEGFP—C1、pGFP—XB及pGFP—XC转染Bel—7402细胞，用G418筛选抗性细胞克隆，在荧光显微镜观察下观察GFP—HBx融合蛋白表达，RT—PCR及Western blot鉴定HBV X基因的转录与表达，以建立稳定表达细胞株Bel—7402/GFP、Bel—7402/GFP—XB、Bel—7402/GFP—XC，用阿霉素(2.5ug/ml)分别处理Bel—7402、Bel—7402/GFP、Bel—7402/GFP—XB、Bel—7402/GFP—XC四组细胞，处理后不同时间在显微镜下观察细胞形态的变化，并用台盼蓝染色计数死亡细胞，实验重复5次。流式细胞仪检测阿霉素处理48h后各组细胞凋亡率，共检测5次，所有数据均以配对t检验进行分析。
实验结果：
经双酶切及测序鉴定成功构建了GFP与B、C基因型HBV X重组表达载体pGFP—XB、pGFP—XC。将pEGFP—C1、pGFP—XB及pGFP—XC转染Bel—7402细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，在荧光显微镜观察下见部分抗性克隆细胞表达较强的GFP荧光蛋白。将带绿色荧光蛋白的抗性克隆细胞扩大培养并经传5代，细胞仍表达强的荧光蛋白，RT—PCR及Western blot检测显示在Bel—7402/GFP—XB、Bel—7402/GFP—XC有HBx基因转录与表达。台盼蓝染色检测表明阿霉素处理的Bel—7402、Bel—7402/GFP细胞发生了明显的时间依赖性死亡，而在Bel—7402/GFP—XB、Bel—7402/GFP—XC和对照组细胞未见明显细胞死亡；流式细胞仪检测显示阿霉素处理48h后，Bel—7402/GFP—XB、Bel—7402/GFP—XC细胞的凋亡率分别为3.87％、4.01％，两者差异无统计学意义(p>0.05)，且与未处理的对照组细胞凋亡率(2.74％、2.91％、3.00％、2.83％)差异无统计学意义(P>0.05)，明显低于Bel—7402(27.05％)，Bel—7402/GFP细胞(29.14％)(P<0.01)。
结论：
1、本实验成功构建了pEGFP—C1与HBV B、C基因型X基因的重组表达载体，建立了稳定表达GFP及HBV B、C基因型X蛋白的稳定表达细胞系，为进一步研究HBVB、C基因型间X蛋白的差异提供了平台。
2、本研究证实了HBx能够抑制阿霉素诱导的细胞凋亡。
3、本研究结果表明HBV B、C基因型X蛋白抑制细胞凋亡的功能无明显的差异，初步提示B、C基因型HBV感染导致肝癌发生率的差异并不是因HBx蛋白抑制细胞凋亡的差别引起，而可能与其他因素有关，进一步提示了肝癌发生发展机制的复杂性，可能肝癌的发生发展除了与HBx抑制细胞凋亡相关外，尚可能与乙型肝炎病毒其他基因及其表达产物有关。