食管癌是常见的一种恶性肿瘤。我国是该疾病的高发区,对其进行有效的治疗成为当前的重要任务之一,但目前尚缺乏对包括此疾病在内的恶性肿瘤进行有效治疗,寻找包括食管癌在内恶性肿瘤的有效治疗方法成为当今研究的热点。　　 研究发现,PI3k/Akt/mTOR信号通路在恶性肿瘤的发生发展等过程中具有重要作用。参与细胞凋亡、转录、翻译、代谢、血管新生以及细胞周期的调控,并且影响着这些细胞的浸润和转移。　　 第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten,PTEN)是一抑癌基因,在PI3K/Akt/mTOR信号转导通路中,PTEN起着“分子开关”的作用,为PI3K/Akt/PTEN/mTOR信号转导通路的主要负性调节因子。　　 反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASODN)可特异性的抑制靶基因的表达但不影响其他基因的正常功能,近年来已广泛用于基因研究,但在食管癌EC9706和EC-1细胞中,利用反义寡核苷酸抑制PTEN的功能后对PI3k/Akt/mTOR信号通路中的各因子会产生怎样的影响,目前尚未见文献报道。　　 该实验采用反义寡核苷酸技术抑制高分化食管癌EC9706和低分化EC-1细胞PTEN的表达,观察浓度为3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L的PTEN ASODN处理食管癌EC9706和EC-1细胞24h、48h、72h后对食管癌细胞增殖、凋亡的影响及PI3K/Akt/mTOR信号通路中PTEN、mTOR、4EBP1、S6K1的表达情况,并比较PTEN ASODN对不同分化程度的食管癌EC9706和EC-1细胞的作用效果,为食管癌的临床治疗提供理论依据。　　 材料和方法：　　 1.高分化的人食管癌EC9706细胞中国医学科学院肿瘤研究所赠送,低分化的EC-1细胞香港大学曹世华教授赠送。　　 2.食管癌EC9706和EC-1细胞的分组培养:将细胞种于3个96孔板和3个24孔板,每板分6组,即:终浓度为3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L的ASODN实验组,终浓度为12μmol/L的SODN对照组组、终浓度为12μmol/L的N-ODN对照组和细胞对照组(不进行转染),每组设3个复孔进行培养。　　 3.利用Lipofecter脂质体介导转染PTEN ASODN于EC9706和EC-1细胞中。　　 4.运用MTT法测各实验组和对照组细胞的相对增殖率。　　 5.运用TUNEL检测实验组和对照组细胞的凋亡。　　 6.利用流式细胞仪测各实验组和对照组细胞增殖周期。　　 7.采用免疫细胞化学检测各实验组和对照组细胞PTEN、mTOR、4EBP1、S6K1蛋白的表达。　　 8.采用原位杂交检测各实验组和对照组细胞PTEN、mTOR的mRNA表达。　　 9.免疫细胞化学和原位杂交结果判定:每张滴爬片标本高倍镜下观察10个视野,采用十三点评分法,即以0～4分来判定阳性细胞的百分比:0分没有阳性细胞；1分,阳性细胞<10％；2分,10％<阳性细胞<50％；3分,50％<阳性细胞<80％；4分,阳性细胞>80％；根据无、弱、中、强的染色强度分别计为0-3分；以两个指标的乘积为最终评分。得分多的,表达强。　　 10.根据各指标检测结果与其对照组比较的相对变化率来判定转染PTEN ASODN对EC9706和EC-1作用效果。　　 11.统计学处理:统计分析采用SPSS10.0软件。计量资料用均数±标准差((X)±S)表示,两组均数的比较用t检验,两组以上均数的比较用单因素方差分析,方差不齐时先进行变量转换,α=0.05为显著性标准。相关性检验采用线性相关分析,-1≤r<0为负相关。　　 结果：　　 1.MTT法测细胞的相对增殖率转染PTEN ASODN后EC9706和EC-1细胞的相对增殖率在3个浓度和3个时间段内均随其增加明显增加,在同一时间不同浓度和同一浓度不同时间差异均有统计学意义(P<0.05),浓度为12μmol/L PTEN ASODN作用72h效应最强;　　 2.TUNEL检测细胞的凋亡结果转染 PTEN ASODN后细胞凋亡指数随浓度和时间增加明显降低,在同一时间不同浓度和同一浓度不同时间差异均有统计学意义(P<0.05),浓度为12μmol/L PTEN ASODN作用72h效应最强；　　 3.流式细胞仪测各实验组和对照组细胞增殖周期。转染PTEN ASODN于EC9706和EC-1细胞后随浓度或时间的增加增殖指数增大。在同一时间不同浓度和同一浓度不同时间差异均有统计学意义(P<0.05),浓度为12μmol/L PTENASODN作用72h效应最强;　　 4.免疫细胞化学结果转染PTEN ASODN于EC9706和EC-1细胞后随浓度或时间的增加mTOR、S6K1蛋白的表达增强,PTEN、4EBP1蛋白的表达降低；在同一时间不同浓度和同一浓度不同时间差异均有统计学意义(P<0.05),浓度为12μmol/L PTEN ASODN作用72h效应最强;　　 5.原位杂交结果转染PTEN ASODN于EC9706和EC-1细胞后随浓度或时间的增加PTEN mRNA表达降低而mTOR mRNA表达增强,在同一时间不同浓度和同一浓度不同时间差异均有统计学意义(P<0.05),浓度为12μmol/L PTENASODN作用72h效应最强;　　 6.转染PTEN ASODN后对EC9706和EC-1细胞作用情况的比较转染PTEN ASODN于EC9706和EC-1细胞后,各指标检测结果与其对照组比较的相对变化率显示,EC9706中各检测指标的相对变化率均大于EC-1细胞,差异有显著性(P<0.05)。提示,转染PTEN ASODN后对EC9706细胞的作用好于EC-1细胞。　　 7.转染PTEN ASODN后对EC9706和EC-1细胞中PTEN与mTOR的相关性检验结果显示,mTOR与PTEN呈负相关(P<0.05,EC9706:-1