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目的:本课题旨在对减毒鼠伤寒沙门菌靶向作为基因载体进行可行性评价,并观察以减毒伤寒沙门菌为载体,介导Tip30、IFN-γ,基因及其联合基因对头颈癌荷瘤裸鼠的治疗作用。 方法:1.以PCR扩增Tip30和人IFN-γ,基因,分别插入真核表达载体pCI—neo,构建成重组表达质粒pCI—Tip30和pCI—IFN,再利用内部核糖体结合位点(IRES)序列构建成Tip30与人IFN-γ,基因的共表达质粒pCI—Tip30/IFN,并用酶切鉴定。2.将重组表达质粒分别转染小鼠NIfl3T3细胞,用免疫印迹试验和ELISA方法对表达产物进行鉴定;对Tip30和人工FN-γ基因分别进行DNA序列测序。3.以绿色荧光蛋白基因为报告基因,将绿色荧光蛋白表达质粒转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,观察其在体外对细胞的感染性和基因呈递作用;将重组菌口服到腺样囊性癌荷瘤裸鼠体内,通过体内基因转移鉴定及稳定性试验检测其在肝、脾、肿瘤组织中靶向分布及存活时间。4.分别将己构建的重组表达质粒pCI-Tip30、pCI-IFN和共表达质粒pCI-Tip30/IFN转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,制备成重组减毒沙门菌SL7207/pCI-Tip30、SI7207/pCI-IFN和SL7207/pCI-Tip30/IFN,体外感染小鼠巨噬细胞株,用免疫印迹和EIJSA对表达产物进行鉴定。5.建立ACC-2、ACC.M和TCA-8113荷瘤裸鼠模型,每种荷瘤裸鼠随机分成5组,分别口服PBS、SL7207、SI7207/pCI—IFN、SL7207/pCI-Tip30和SL7207/pCI-Tip30/IFN对其进行治疗;分别检测:裸鼠体内肿瘤细胞内IFN—γ、Tip30的表达、肿瘤生长体积、瘤体重量、带瘤存活期、肿瘤微血管密度(MVD)和肿瘤细胞凋亡。 结果:1.成功构建了质粒pCI一Tip30、pCI一Tip30/IFN和共表达质粒pCI—Tip30/IFN,酶切鉴定显示切出的DNA片断与已知相符。2.免疫印迹试验<WP=9>表明质粒pCI—Tip30和pCI—Tip30/IFN均能在NI}13T3细胞内表达Tip30蛋白,ELISA检测显示pcI—IFN和pCI—Tip30/IFN均能在NIH3T3细胞内表达人IFN一γ。3.体外试验表明减毒鼠伤寒沙门菌能有效感染靶细胞并进行基因转移;体内试验表明减毒鼠伤寒沙门菌能在肝、脾及肿瘤组织中能存活及表达,但以肿瘤中聚集明显且维持时间较长。4.免疫印迹试验表明质粒pCI-Tip30和pCI-Tip30/IFN转化菌感染的小鼠巨噬细胞能表达Tip30蛋白,ELISA检测则显示pCI-IFN和pCI-Tip30/IFN转化菌感染的小鼠巨噬细胞能表达人IFN-γ。 5.在三种荷瘤裸鼠治疗组体内肿瘤细胞胞浆内有对应表达IFN—Y、Tip30; 各治疗组均较对照组肿瘤生长慢,肿瘤体积小,重量轻,抑瘤率高,带瘤存活期长;携带基因治疗组较SL7207治疗组肿瘤生长慢,肿瘤体积小,重量轻,抑瘤率高,带瘤存活期长;联合基因治疗组较单基因治疗组肿瘤生长慢,肿瘤体积小,重量轻,抑瘤率高,带瘤存活期长。携带Tip30基因治疗组肿瘤组织中微血管密度较SL7207和PBS组低,且肿瘤细胞出现明显的凋亡改变,琼脂糖凝胶电泳出现典型的DNA梯状条带。 结论:1.减毒伤寒沙门菌能作为外源性基因载体,在体内外均可进行基因呈递,在体内有肿瘤靶向性。2.减毒伤寒沙门菌靶向介导的Tip30,IFN-γ,及其联合基因,对头颈癌荷瘤裸鼠有治疗作用;联合基因较单基因治疗效果好,有协同作用。