精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)(ATP：Arginine N-phosphotransferaseEC2.7.3.3)属于磷酸原激酶家族中的重要一员，广泛存在于无脊椎动物及软体动物中，起着类似于脊椎动物中肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)(ATP：Creatine N-phosphotransferase EC2.7.3.2)的作用，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩以及ATP再生有直接关系的重要激酶。磷酸原激酶家族是一个保守家族，可逆催化肌酸或精氨酸与ATP之间的转磷酰基反应，形成的高能磷酸化的磷酸肌酸或磷酸精氨酸称为磷酸原。本研究对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)精氨酸激酶基因重新进行克隆得到BxAK1和BxAK2，然后研究了这2个基因原核表达及其重组蛋白的分离纯化方法，旨在为研究新型杀线剂，防治松材线虫打下基础。本试验的主要创新性结果如下：　　1.构建了精氨酸激酶的原核表达载体　　提取松材线虫的总RNA，用RT-PCR方法反转录得到精氨酸激酶基因BxAK1和BxAK2的cDNA全长。分别以BxAK1和BxAK1的质粒DNA为模板，用引物分别扩增引入单一酶切位点BamHⅠ和HindⅢ的2个目的片段，分别连接到pMD18-T，形成pMD18-T-BxAK1和pMD18-T-BxAK2重组质粒；对重组质粒DNA和pET-32a(+)的质粒DNA同步进行双酶切，重组质粒pMD18-T-BxAK1和pMD18-T-BxAK2酶切后的目的片段分别与pET-32a(+)酶切后的目的片段，在T4 DNA连接酶的作用下，形成重组质粒pET-32a-BxAK1和pET-32a-BxAK2，分别转入大肠杆菌BL21中进行原核表达。37℃，振荡培养2-3h(OD600=0.6-0.8)，加入100mg/mL IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃诱导5小时，取1mL菌液，12000rpm离心1min，收集菌体；100℃加热5min；将样品取出冷却至室温，12000rpm离心3-5min；取10μl上清进行SDS-PAGE电泳检测。SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot检测结果显示：无论是否使用IPTG诱导，重组质粒pET-32a-BxAK1和pET-32a-BxAK2均可以成功表达，目的蛋白分别约为56KDa和61KDa。　　2.建立了重组精氨酸激酶的纯化方法　　分别将扩繁后的含有重组表达质粒pET-32a-BxAK1和pET-32a-BxAK2的菌体冷冻离心后，其沉淀用PBS Buffer洗涤，再次冷冻离心后的沉淀用蛋白Buffer A平衡，冰浴超声波破碎处理并离心，得到含有精氨酸激酶蛋白混合液；进样到镍柱亲合层析仪，通过不同咪唑梯度的蛋白Buffer A、蛋白Buffer B、蛋白Buffer C洗脱后，得到尿素溶解的精氨酸激酶蛋白，然后用不同尿素浓度梯度的PBS Buffer透析后，可以得到所要的复性的重组精氨酸激酶，SDS-PAGE检测得到单一目的条带，并且目的蛋白的大小与纯化前保持一致。