论文部分内容阅读
烟草是我国重要的经济作物。黑龙江省是我国烟叶主要产区之一，所产烟叶以物理特性好、烟碱含量低等优点著称。马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是危害黑龙江烟叶生产的主要病毒。PVY侵染烟草后产生花叶和叶脉坏死症状，TMV产生花叶和畸形症状。目前生产上没有高抗PVY和TMV的主栽品种，也缺少有效的抗病毒药剂。交叉保护是防治植物病毒病的有效方法。本文在明确黑龙江烟草PVY和TMV分子株系的基础上，利用已经获得的烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）弱毒疫苗筛选防治PVY和TMV的有效片段，并在田间进行了验证。主要结果如下： 1、测定了黑龙江省Harbin和Mudanjiang两个PVY分离物的基因组序列，并进行了一致率、重组、系统发育和选择压力等分析，证明两个分离物均属PVYN-Wi株系。分离物Harbin和Mudanjiang（GenBank登录号分别为MH933741和MH933742）基因组全长均为9699核苷酸。Harbin与Mudanjiang和比利时分离物GBVC26（JQ969039）一致率最高，为98.5%；Mudanjiang与Harbin和GBVC26一致率最高，为98.5%。Harbin是美国分离物Oz和瑞士分离物N-605的重组体，MDJ是美国分离物CW和N-605的重组体。利用全基因组序列构建的系统进化树显示，PVY分离物分为9个株系，Harbin和MDJ均属PVYN-Wi株系。PVY的11个基因均处于负选择，其中核内含体a基因的选择压力最大。 2、测定了黑龙江省HEB1、HEB2和MDJ三个TMV分离物的基因组序列，并进行了一致率、重组、系统发育和选择压力等分析，证明HEB1和MDJ属U1株系，HEB2属Rakkyo株系。分离物HEB1、HEB2和MDJ全长均为6395核苷酸（GenBank登录号分别为MH595919、MH595920和MH595921）。HEB1和MDJ与辽宁分离物Beipiao（HE818412）一致率最高，分别为98.9%和99.6%；HEB2与云南分离物Chuxiong1（HE818417）一致率最高，为97.1%。HEB1是MDJ和HEB2的重组体。在根据全基因组序列构建的系统进化树中，TMV分为3个分子株系，其中HEB1和MDJ均属Ⅰ（U1）株系，HEB2属Ⅱ（Rakkyo）株系。TMV的4个基因均处于负选择，其中衣壳蛋白基因的选择压力最大。 3、筛选到能有效介导对黑龙江PVY和TMV抗性的有效片段。通过比对本文测定的及Genbank中注册的PVY和TMV分离物基因组序列获得保守序列，利用siRNADirect网站筛选可能高效表达siRNA的片段，得到3个针对PVY的片段（PVYF1、PVYF2、PVYF3）和3个针对TMV的片段（TMVF1、TMVF2、TMVF3）。将6个片段分别连接TVBMV弱毒突变体，转化农杆菌感受态GV3101制成单联弱毒疫苗，分别命名为PVY1、PVY2、PVY3、TMV1、TMV2和TMV3。通过农杆菌浸润接种普通烟，15天后挑战接种强毒株系。挑战接种后15天检查结果，PVY2和TMV3两个弱毒疫苗能分别介导烟草对PVY和TMV的抗性。其中，PVY2的保护率为75%，病毒积累量降低89.27%；TMV3可显著减轻TMV的症状，病毒积累量降低67.20%。 4、在山东省临沂市、潍坊市以及黑龙江省哈尔滨市三地烟田测定了弱毒疫苗PVY2和TMV3的交叉保护效果。PVY2和TMV3对黑龙江烟草PVY和TMV的相对防效分别为66.88%和80.74％。PVY2对山东临沂和潍坊烟草PVY的相对防效分别为76.46%和60.71％，TMV3对山东临沂和潍坊烟草TMV的相对防效分别为87.34%和74.40％。