龙须菜降解产物的活性研究及降解菌Flammeovirga pacifica中硫酸酯酶基因的克隆表达

来源 :国家海洋局第三海洋研究所 | 被引量 : 3次 | 上传用户:wenshicai2009
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本文利用一株从太平洋深海沉积物筛选到的可直接降解龙须菜产生寡糖的菌株Flammeovirgapacifica进行相关研究。从Flammeovirgapacifica的全基因组序列中,我们发现了80余个可能的硫酸酯酶基因。通过NCBI比对,选取了同源性最高的芳香基硫酸酯酶基因Ary423进行克隆表达。该基因含有1536个碱基,编码511个氨基酸,预测分子量为57.2KD,预测等电点为5.9。SignalP3.0server软件分析该基因的前21个氨基酸为信号肽。利用pET-His构建了Ary423的表达载体并转化到E.coliBL21中,IPTG诱导其表达,经过条件优化,获得了在非变性条件下纯化的His融合蛋白。酶活检测表明,具有降解PNPS的活性。并且可以降解龙须菜粗多糖,脱去粗多糖的硫酸根。该重组菌的最适温度为40℃,最适pH为8-9。Mg2+离子对酶有较为明显的激活作用,Fe3+,Cu2+能抑制酶的活力。巯基乙醇,尿素,10mmol/L的EDTA对其有一定的抑制作用。利用该菌株降解龙须菜直接产生的寡糖,我们分别从抑菌,促生长,抗氧化,以及保鲜等几个方面做了应用方面的研究。通过实验发现,80ppm的寡糖发酵液能够显著地促进小浮萍的生长,通过电子显微镜镜检发现,与对照相比,培养基中加入寡糖的小浮萍气孔变大,组织细胞变大。在抑制微生物生长方面,我们选取了常见的几种真菌(黑曲霉,宛氏拟青霉,黄萎病菌,核盘菌)和细菌(大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,溶藻活菌,副溶血弧菌)。实验结果发现寡糖溶液能够显著抑制核盘菌的生长,1.6mg/mL的寡糖溶液的抑菌率可以达到50%。但对其他真菌和所有的细菌均没有抑制作用。具体的抑菌机理还有待进一步研究。在抗氧化活性方面,我们分别以果蝇对百草枯的抗性,邻苯三酚自氧化,清除DPPH自由基为模型。实验结果发现,寡糖能显著的提高雌性果蝇的寿命,减缓邻苯三酚的自氧化速率,有效地清除DPPH自由基。在草莓保鲜方面,寡糖可以具有减少水分流失的以及减少贮藏草莓Vc损失的作用。我们对寡糖样品进行了包括冷冻干燥,喷雾干燥,活性炭脱色等后处理,并通过离子色谱检测寡糖的变化情况。以期对寡糖的保存提供依据。
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