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目的:探究二十二碳六烯酸(DHA)对人胃癌细胞SGC-7901生长的影响及诱导细胞凋亡的作用机制。
方法:
1、MTT法测定DHA对人胃癌细胞SGC-7901增殖的影响;2、Hoechst染色法进行细胞形态学观察,观察DHA处理细胞时形态学的变化;3、Annexin V/PI双染流式细胞术对细胞凋亡定量分析;4、DHA处理后SOD活性的变化;5、硫代巴比妥钠比色法(TBA法)测定细胞脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量变化;6、二硫代二硝基苯甲酸(DNTB)比色法测定谷胱甘肽(GSH)含量7、荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平变化;8、DNA琼脂糖凝胶电泳检测SGC-7901细胞凋亡的典型生化改变-DNA的片段化;9、荧光染料罗丹明123检测细胞线粒体膜电位变化。
结果:
1、MTT法显示DHA能有效抑制SGC-7901细胞的增殖,处理24 h后其IC50为80μmol·L-1,且与药物浓度和作用时间呈正相关。而高浓度的DHA虽然对绿猴肾细胞vero增殖有一定的影响,但没有显著性差异。
2、Hoechst染色表明DHA处理SGC-7901细胞后,呈现明显的凋亡形态,细胞核染色质出现碎片和浓缩现象,染色荧光增强。
3、Annexin V/PI双染流式检测表明DHA处理后,细胞凋亡率显著增加,有浓度和时间效应关系。
4、DHA处理细胞后,SOD活性上升;抗氧化剂NAC预处理可以显著降低SOD的活性。
5、脂质过氧化产物丙二醛的含量随着DHA的浓度升高而增加;NAC和DHA复合处理组的MDA水平有所下降。
6、DNTB法测定GSH结果显示DHA处理细胞后,胞内GSH水平下降;NAC是一种抗氧化剂,也是GSH的前体,可以对抗DHA导致GSH的损耗。
7、荧光探针DCFH-DA检测ROS水平,其随DHA但随着作用时间的延长,出现一个峰值,随后恢复到本底水平。
8、DNA琼脂糖凝胶电泳表明DHA处理细胞后,细胞DNA呈梯状排列,是凋亡的典型生化指标,而抗氧化剂NAC可以消除这一现象。
8、荧光染料罗丹明123检测膜电位,表明DHA处理细胞后,细胞内的膜电位并未发生变化。
结论:
1、DHA可以抑制SGC-7901细胞增殖,诱导细胞凋亡,发挥体外抗胃癌作用。
2、DHA处理细胞后,细胞内的MDA水平增高,GSH含量降低,而抗氧化剂NAC可以对抗这一现象。说明在DHA诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡的过程中,脂质过氧化是其中的原因之一;
3、在DHA处理细胞5h后,细胞内的ROS出现一个峰值;处理48h后,DNA呈现梯状条带。NAC预处理,可以降低细胞内的ROS水平。但是,此过程中,线粒体膜电位并没有发生变化。DHA诱导胃癌细胞SGC-7901凋亡,ROS升高可能是DHA诱导细胞凋亡的重要机制。