鸡白痢沙门氏菌毒力因子分析及对SPF鸡致病性研究

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沙门氏菌的各种血清型可对人、畜、禽和野生动物引起疾病,沙门氏菌引发的疾病遍布世界各地,许多血清型的沙门氏菌可使人感染并发生食物中毒。近年来,禽沙门氏菌病的发生日趋严重,鸡白痢是其中的一种,而且此病在流行、发生、临床表现及剖检变化、药物敏感性等许多方面都发生了一些新的特点,目前在鸡白痢病方面还没有一种有效的疫苗防治。本研究对收集的禽源沙门氏菌进行鉴定,耐药性和毒力基因的分析,并筛选了其中两株鸡白痢沙门氏菌,运用病理组织学和免疫组织化学方法进行致病性研究。  1、禽源沙门氏菌的鉴定及血清型分析  本试验对收集的10株背景清晰的禽源沙门氏菌,进行培养,革兰氏染色、PCR鉴定、血清型测序分析及生化实验,并以肠炎沙门氏菌参考标准株作为对照。结果表明鸡源沙门氏菌中有2株为鸡白痢沙门氏菌,1株为猪霍乱沙门氏菌;鸭源沙门氏菌中有1株为肠炎沙门氏菌,6株为鼠伤寒沙门氏菌。  2、禽源沙门氏菌的耐药基因检测及耐药性分析  通过K-B(Kirby-Bauer)法对收集的10株沙门氏菌进行14种药物敏感试验及11种对应的耐药基因PCR检测,并以大肠杆菌ATCC25922作为对照。检测结果表明对链霉素的耐药率最高,达到了70%;对氨苄西林的耐药率为30%;对阿莫西林,诺氟沙星,四环素,复方新诺明的耐药率均为20%;对头孢西林,卡那霉素,庆大霉素,氯霉素的耐药率均为10%;对头孢哌酮,新霉素,氧氟沙星,诺氟沙星均表现出敏感性,有四株菌表现为多重耐药;耐药基因检测结果表明耐药基因catA1在的检出率为100%;aadA1,aadA2,sulⅠ的检出率在50%以上,qnrB,tetB,blaTEM,tetA,sulⅡ的检出率低于35%;blaPSE,qnrA,tetG检出率为0。分析沙门氏菌耐药性的结果与耐药基因的结果表明,药物的耐药表型与耐药基因的检出率基本一致,细菌所携带的耐药基因与其对药物耐药性呈正相关,沙门氏菌DNA上携带的耐药基因能很大程度的决定其耐药性。  3、禽源沙门氏菌的毒力基因检测  采用PCR技术检测了10株沙门氏菌15个毒力基因,它们已知参与沙门氏菌的粘附,侵袭和存活。检测结果表明大多数沙门氏菌对选择的大多数毒力基因都是阳性的,携带率均在80%以上,其中1号菌株携带检测的全部毒力基因;pipD,fimA,misL,sopA,invA,stn,spvC,spiC,sifA和orf319的检出率均为100%;virK的携带率为90%;sipA的携带率为80%;spvB的携带率为60%;fliC的携带率为40%。  4、鸡白痢沙门氏菌的致病性研究  根据10株菌的感染宿主的临床症状,毒力基因检测,筛选两株鸡白痢进行动物致死性感染试验,筛选出致病性较强的一株测定半数致死量试验,以此为依据进行动物感染试验,同期根据药敏试验结果选用临床兽用药进行抗生素治疗试验。经腹腔注射,分别在感染第1d、3d、5d、7d、10d、15d取SPF鸡的心、肝、脾、肺、盲肠、法氏囊进行HE染色,选取肝脏和盲肠测定载菌量;选取损伤最为严重的肝进行毒力蛋白SpiC的定位及相关肝损伤指标的免疫组织化学染色。  在感染第3d到第7d是死亡高峰期,也是各器官损伤最严重的时期。同期肝脏Spic的表达范围最广,表达量最高,与肝脏坏死灶的分布一致,说明毒力蛋白与肝损伤有关。Caspase-1和Caspase-3也在此期间高表达,说明了在此期间肝脏受到损伤,即细菌感染导致动物的器官损伤,因此使宿主发病。
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