研究背景：刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种细胞内寄生的单细胞原虫，能感染几乎所有恒温动物(包括人类)，引起人兽共患的弓形虫病。此虫呈世界性分布，估计全世界成年人中至少有1/3的人感染。弓形虫作为一种机会性致病原虫，在免疫功能正常的宿主体内通常形成包囊，造成隐性感染，短则数月，长则数年甚至终生寄生在人体。而一旦机体免疫功能下降(如肿瘤患者、器官移植者及AIDS患者等)，处于隐性感染状态的虫体就会活化，迅速增生繁殖，在宿主体内播散引起弓形虫病甚至导致宿主死亡。妇女在妊娠期初次感染弓形虫可引起流产、畸胎、死胎，或引起胎儿先天性弓形虫病，表现为智力低下、视网膜脉络膜炎、失明等，这些症状可在胎儿出生时或是成长过程中出现。因此，弓形虫病的诊断及疫苗研制对于保护特殊易感人群以及促进人类优生优育具有重要意义。 弓形虫机会性致病的生物学基础是速殖子和缓殖子的相互转换，弄清楚相互转换的机制对于控制弓形虫病有重要意义。速殖子与缓殖子相互转换的过程主要是不同期特异性抗原分子的表达的过程，因此这些特异抗原分子的确定是研究转换机制的先决条件，克隆期特异抗原基因即为研究转换机制创造条件。由于速殖子容易获得，便于对其进行研究，许多弓形虫基因已从速殖子中克隆、鉴定，其中大多数基因编码的蛋白为速殖子与缓殖子共有的，只有少数几个被证实为速殖子期特有的，近年来，由于速殖子与缓殖子相互转换机制引起研究者重视，一些缓殖子及包囊特有的蛋白的基因也已被克隆、鉴定。本研究对缓殖子期特异性抗原BAGl与SAG4进行基因克隆、蛋白表达以及对重组抗原的免疫反应性进行分析；进一步优化蛋白的表达条件，纯化表达蛋白以获得大量高纯度的重组蛋白，为进一步的研究创造了条件。并且探讨重组抗原作为新型诊断抗原的可能性；进一步筛选、鉴定针对重组BAG1的单克隆抗体，为弓形虫缓殖子的进一步研究打下基础。 目的： 1．克隆与表达弓形虫缓殖子期特异抗原BAG1、SAG4的基因，并分析重组表达抗原的免疫反应性； 2．纯化表达蛋白，获取大量高纯度的重组抗原，探讨重组抗原在弓形虫病诊断上的应用； 3．制备、鉴定抗重组BAG1的单克隆抗体，为弓形虫缓殖子的进一步研究打下基础。 方法： 1．诱导体外培养的RH株弓形虫速殖子向缓殖子转化，采用RT-PCR从缓殖子中扩增BAGl基因片段；采用PCR从弓形虫基因组DNA中扩增SAG4基因片段； 2．利用酶切、连接反应构建pMD 18-T-BAG1重组质粒、pGEX4T-1-SAG4重组质粒，并进行测序分析； 3．利用限制性内切酶双酶切pMD 18-T-BAG1，切下BAG1基因片段插入以同样限制性内切酶双酶切的质粒pET32a(+)中，构建表达重组质粒pET32a(+)-BAG1，并对重组质粒进行酶切及测序鉴定； 4．将重组质粒pET32a(+)-BAG1、pGEX4T-1-SAG4分别转入BL21(DE3)中，用XPTG诱导表达； 5．优化工程菌pET32a(+)-BAG1/BL21、pGEX4T-1-SAG4/BL21的表达条件，大量诱导表达后对重组蛋白进行纯化； 6．Western blotting与ELISA分析重组表达蛋白的免疫反应性； 7．通过ELISA试验，用重组抗原对人血清进行检测； 8．应用杂交瘤技术，将小鼠SP2/0细胞与经重组BAG1免疫的小鼠脾细胞融合，筛选抗重组BAG1的单克隆抗体，并进行鉴定。 结果： 1．克隆了弓形虫缓殖子期特异抗原BAG1、SAG4的编码基因； 2．成功构建克隆重组质粒pMD 18-T-BAGl与表达重组质粒pET32a(+)-BAG1,pGEX4T-1-SAG4，通过IPTG诱导得到以可溶性形式高效表达的重组BAG1与主要以包涵体形式表达的重组SAG4，Western blotting分析显示重组BAG1、重组SAG4均具有特异的免疫反应性； 3．用重组BAGl检测350份人血清中弓形虫IgG抗体，结果显示其阳性率高于对照的重组SAG1检测的阳性率，P=0.033；两种重组抗原检测的总阳性率为23.14％； 4．筛选了四株针对重组BAG1的单克隆抗体，Western blotting结果显示四株单克隆抗体与弓形虫BAG1抗原具有良好的免疫反应性。 结论： 1．首次从碱诱导法培养的弓形虫RH株中，克隆出缓殖子期特异抗原BAG1和SAG4的基因编码序列； 2．在大肠埃希菌中分别以可溶性形式与包涵体形式高效表达了BAG1基因与SAG4基因，重组表达抗原均具有特异的免疫反应性； 3．将重组BAG1应用于人弓形虫感染的检测，结果显示缓殖子期特异抗原可能可以特异检测弓形虫的慢性感染； 4．筛选、鉴定的四株抗重组BAG1的单克隆抗体，可进一步应用于弓形虫缓殖子的研究。 附篇一种广州管圆线虫新基因——胶原蛋白全长cDNA序列的克隆、鉴定及生物信息学分析研究背景：广州管圆线虫病(Angiostrotlgyliasis)是由广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)幼虫寄生于人体中枢神经系统而引发的疾病。近年来，由于不少人喜欢生食或半生食水产品，使得广州管圆线虫病的发病率在明显上升。作为一种新发传染病的病原，广州管圆线虫的许多生物学特性，尤其是分子生物学方面，还未被人们所认知。鉴于广州管圆线虫在人体的感染和致病阶段主要为幼虫，本研究根据广州管圆线虫幼虫的cDNA文库表达序列标签(expression seqtlence tag，EST)测序结果，采用PCR技术克隆并鉴定了广州管圆线虫胶原蛋白(Collagen，COL)基因的全长cDNA序列，为广州管圆线虫病的分子生物学诊断创造条件；并构建了新基因的原核表达重组质粒，为下一步的深入研究创造了条件。 目的： 1．克隆、鉴定广州管圆线虫(A．cantonellsis)新基因——胶原蛋白(Collagen，COL)基因。 2．对新基因进行鉴定和生物信息学分析。 3．构建重组克隆质粒pMD18-T-AcCOl与重组表达质粒pET32a(+)-AcCOL。 方法： 1．根据表达序列标签(Expression sequence tag，EST)中部分序列和文库载体序列设计引物，采用PCR技术从广州管圆线虫幼虫的cDNA文库中分段扩增cDNA序列，用DNAMAN软件拼接分段扩增的序列以得到全长cDNA序列。 2．用多种生物信息学软件对cDNA全长序列进行同源性搜索与结构分析。 3．根据cDNA全长序列，设计新的引物从文库中扩出包含胶原蛋白全长开放阅读框(Open reading frame，ORF)的cDNA片段，PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上并测序。重组T载体经双酶切后切下的新基因AcCOL，再亚克隆到原核表达质粒pET32a(+)中。 结果： 1．克隆了一个广州管圆线虫新基因的全长cDNA序列。 2．序列比对、蛋白结构域搜索及结构分析结果显示，该新基因所编码的蛋白质具有胶原蛋白的性质。 3．构建的新基因重组质粒经双酶切与测序证明目标片段已插入质粒载体中，且插入序列与读码框正确。 结论： 克隆并鉴定了广州管圆线虫新胶原蛋白基因，构建了该基因的克隆重组体pMD18-T-AcCOL与原核表达重组体pET32a(+)-AcCOL。