论文部分内容阅读
本文用紫外光谱、荧光光谱和电泳等技术研究了Doxorbicin、Daunomycin与人cyclinA基因的相互作用。首先是构建质粒,在此基础上大量提取cyclinA基因:紫外光谱、荧光光谱和圆二色谱研究结果表明:Daunomycin和Doxorubicin与cyclinA基因作用后,Daunomycin和Doxorubicin的紫外光谱480m处特征吸收峰发生减色效应,荧光强度降低。且Daunomycin能够对cyclinA基因的二级结构产生影响。同时测定了两种药物与cyclinA基因的结合常数,分别为0.78×106(Daunomycin)、1.577×106(Doxorubicin),即Doxorubicin与cyclinA基因的结合强度大于Daunomycin与cyclinA基因的结合强度,而且热变性实验也证明了这一结果。该基因与这两种药物结合后,均使cyclinA基因的稳定性增加,即Tm值升高,但由Doxorubicin引起的升高大于由Daunomycin引起的变化。由于药物与cyclinA基因的紧密结合,不仅可以影响到cyclinA基因的扩增,还能够影响cyclinA基因的表达。细胞试验的结果表明,随着Doxorubicin的浓度增加,细胞大多都停留在S期,影响细胞周期的进程。应用基因工程技术构建了cyclinA基因表达体系,为了高效表达具有生物活性的外源蛋白,并且便于提纯,使用pET-28(a)作为表达载体,并在外源蛋白末端连接6×His-tag标签来表达融合蛋白。通过酶切法和PCR法鉴定,cyclinA基因成功的定向克隆到载体pET-28(a)上。而且建立了cyclinA蛋白纯化方法,得到了电泳纯的重组蛋白。