肝细胞癌(HCC)是人类最常见的致命性肿瘤之一,在全球肿瘤死亡原因中排列第五,中国大陆肝癌发病率占全球发病率的55%。根治性切除是HCC治疗的首选治疗方法,但是预后尚不理想,首要原因是肝内复发。寻找理想的肝癌术后预后价值指标,并据此选择合理的辅助治疗对改善预后有重要意义。目前临床上对肝癌预后的判断主要依靠临床病理学,如TNM分期,但是它仅能对中晚期肝癌较好的做出预后判断,对于病理特征较相似的早期肝癌则在应用上有缺陷。近年研究表明,早期肝癌尽管有相似的临床病理特征,但根治性切除后病人的复发和生存情况却迥异,较大部分患者术后也会出现早期复发,据报道五年复发率近60%；按当前肝癌治疗方法的共识(如Barcelona Clinic Liver Cancer)接受肝切除者多为早期肝癌,并且随着高危人群防癌意识和早诊水平的提高,临床上早期肝癌接受肝切除者日益增加,故寻找对早期肝癌预后判断的分子标记甚为重要,迄今为止应用临床的肝癌术后预后分子标志,尤其是适用于早期者仍然缺乏。因此探索与肝癌转移和复发相关的分子,研究其调节肝癌细胞增殖和侵袭的机制,并按照该分子区分患者的预后,具有重要的临床意义。本课题在我们既往以基因芯片筛选出肝癌组织中AAH特异性高表达和体外能够调节肝癌细胞增殖、侵袭的基础上,研究AAH的调节机制以及其表达水平对肝癌术后预后尤其是探索其对早期肝癌预后的是否有判断作用,为使其成为肝癌治疗靶点提供理论和临床依据。第一部分AAH(天冬氨酸β羟化酶)在肝癌中的表达和临床意义目的在前期研究AAH在肝癌组织中特异性高表达和体外能够调节肝癌细胞增殖、侵袭的基础上,研究AAH的表达水平对肝癌术后预后的影响,尤其是对早期肝癌预后的预测。方法cDNA芯片研究配对肝癌组织和癌旁组织中基因表达情况,并以RT-PCR和免疫组化证实cDNA芯片的结果。前瞻性观察2004.1-2004.6中连续入组的233例接受根治性切除患者癌组织中AAH的表达水平和预后的关系,特别是对BCLC早期(O/A)患者的预后。结果cDNA芯片检测肝癌基因表达谱发现AAH在肝癌组织中的表达比癌旁组织高12.5倍,RT-PCR和免疫组化分别从mRNA和蛋白水平证实AAH在肝癌组织中呈过表达。分析发现AAH的表达水平与肿瘤患者血清AFP水平、肿瘤直径、肿瘤数目和TNM分期有关；AAH高表达患者复发率显著高于低表达患者,生存率则相反；多因素分析AAH是影响患者复发和生存的独立因素(hazard ratio HR,95%confidence interval, CI,复发：3.161,2.115-4.724, P<0.001;生存：2.712,1.734-4.241,P<0.001)。在BCLC A期患者中,AAH高表达患者复发率高于低表达患者,生存率相反,这在]3CLC A期直径≤5cm和>5cm患者中也得到类似的结果。而AAH的表达水平对BCLC B和C期患者术后预后没有统计学差异。小结肝癌组织中AAH的表达水平与肝癌患者术后预后有关,对BCLC早期肝癌患者预后有预测作用,AAH高表达患者术后可能会出现复发和转移。第二部分Gas6/Ax1信号通路与AAH的关系及其功能目的研究AAH调节肝癌增殖和侵袭的部分机制。方法检测Gas6/Ax1在肝癌组织和肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B、PL、Hu7和正常肝细胞系L02中的表达情况；调节AAH在肝癌细胞系SMMC-7721中的表达,western blot检测下游分子Axl活性形式的表达变化以及活性形式的Axl表达变化时,肝癌细胞增殖和侵袭能力的改变,最后以免疫共沉淀证明AAH参与了Gas6/Ax1的相互作用。结果Axl在癌组织和肝癌细胞系中的表达水平高于癌旁组织和正常肝细胞系,而Gas6表达则无差异。调节AAH在肝癌细胞系SMMC-7721中表达时,活性形式的Axl的表达出现同向变化。体外上调Axl表达时,肝癌细胞系SMMC-7721的增殖加快、侵袭能力提高；下调Axl表达时出现相反的变化。免疫共沉淀证明AAH参与了Gas6和Axl相互作用。小结AAH调节肝癌增殖和侵袭可能部分通过Gas6/Ax1信号通路实现,Axl受体在肝癌中起癌基因作用。第三部分Notch1与AAH的关系及其在早期肝癌术后预后中的作用目的Notch家族的配体和受体都有大量的EGF样结构,本部分证明Notch1也受AAH的调节。鉴于Notch1信号通路的功能以及在肿瘤发生中作用,我们推测Notch1在肝癌中的表达变化在肿瘤发生中很早就表现出来,对早期肝癌术后预后有预测作用。方法检测Notch1-4受体在肝癌组织和肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B、PLC、Hu7中的表达情况；调节AAH在肝癌细胞系Hu7中的表达,westernblot检测Notch1的表达变化。前瞻性选取2004.1-2004.7年246例根治性切除的肝癌患者为研究对象,以RT-PCR,实时定量RT-PCR、western blot和免疫组化检测Notch1在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况,分析其表达水平对直径=5cm和BCLC 0/A期患者的预后的预测作用,并以回顾性研究本院1996-2001年随机选取的227例患者的Notch1的表达水平与预后的关系验证前瞻性研究的结果。结果除Notch1在肝癌细胞系Hu7中表达外，Notch1、2在肝癌组织和肝癌细胞系中都不表达,Notch3和Notch4在肝癌中表达不规则。调节AAH在肝癌细胞系Hu7中表达时,Notch1的表达出现同向变化。Notch1在肝癌组织中的表达低于配对癌旁组织。在前瞻性队列直径=5cm组中,Notch1低表达患者肿瘤复发时间比高表达患者短,患者生存时间相反。多因素分析发现Notch1的表达水平是影响肝癌复发和生存的独立因素。回顾性队列中的结果也证实了这一点。两个队列中还发现Notch1的表达水平对BCLC 0/A期患者的预后也是一个独立影响因素。小结Notchl也受AAH调节,在肝癌中可能发挥抑癌基因作用,其表达水平与早期肝癌患者根治性切除术后预后密切相关。全文结论：AAH在肝癌组织中高表达,能够调节肝癌细胞的增殖和侵袭,并与肝癌患者根治性切除术后预后相关。AAH能够调节癌基因Axl受体的表达,其作用部分机制可能通过Gas6/Ax1信号通路。Notch1也受AAH调节,由于其在肝癌中可能发挥抑癌基因作用,故AAH不通过Notch1通路调节肝癌的增殖和侵袭,但是其表达水平与早期肝癌患者根治性切除术后预后密切相关。