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脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是一种严重危害人类健康的疾病,其年发病率为10-30/10万人,在所有类型的卒中中约占10%至30%。脑出血多发生于基底神经节区,患者常见症状有偏瘫、偏身感觉障碍和偏盲,目前认为基底节区的白质损伤引起了这些症状,但确切的机制仍然不清楚,且尚无有效治疗药物。深入研究出血性脑卒中中白质损伤机制,可能为这类疾病的治疗提供新的靶点。瞬时受体电位锚定蛋白1(TRPA1)通道是一种非选择性阳离子通道,激活后引发钙离子等阳性离子内流。目前发现该通道参与了体内多个生理病理过程,如温度、机械应力及伤害性刺激的感受、咳嗽反应等。本研究发现瞬时受体电位锚定蛋白1通道参与小鼠脑出血模型中的髓鞘损伤和氧化应激损伤,对其进行干预可能有助于改善出血性脑卒中病人运动功能。一、脑出血小鼠的神经纤维束损伤和运动功能障碍目的探索小鼠脑出血后运动功能和神经纤维束的改变方法使用自体血注射模型在成年雄性C57BL/6小鼠(8-10周龄,22-30g)脑中进行脑出血造模。将小鼠随机分成两组:Sham组和ICH组。用L-α-溶血磷脂酰胆碱构建脱髓鞘模型。采用免疫荧光(n≥3)、蛋白质印迹分析(n≥3)、透射电子显微镜(n=3)、电生理记录(n=3)、称重(n=6)和行为学测试(n=6)等方法,分析了荧光强度、灰度值、髓鞘评分、G值、运动诱发电位潜伏期、体重和行为学分数等指标。结果1.从造模当天到造模后第三天,脑出血组小鼠在BMS和爬杆平衡实验中的得分均低于假手术组小鼠,脑出血组小鼠的前肢肌肉力量低于假手术组小鼠。在造模后的第七天和第十四天,两组小鼠的BMS评分,爬杆平衡实验评分和前肢肌肉力量没有显著性差异。在整个实验期间,两组小鼠的体重没有显著性差异。2.与假手术组小鼠相比,脑出血组小鼠的运动诱发电位潜伏期在造模后第一天和第三天显著延长,在造模后的第七天和第十四天恢复到假手术组水平。3.对小鼠脑的冠状切片进行免疫荧光染色,在脑出血后第一天和第三天,血肿周围区域MBP蛋白表达减少,在第七天和第十四天逐渐恢复。用WB检测MBP蛋白表达量显示出类似的趋势。脑出血后DMBP免疫荧光染色增强,表明髓鞘降解的增加。此外,脑出血后NF200的免疫荧光变化情况与MBP类似。4.在透射电镜下观察,血肿周围白质存在轴突水肿和髓鞘崩解的现象,同时G值的增加表明髓鞘变薄。将脑出血小鼠血肿周围的髓鞘与脱髓鞘模型小鼠的髓鞘进行比较,发现它们白质的病理变化相似。结论以上这些结果表明小鼠脑出血后前三天存在严重的神经纤维束损伤和运动功能障碍。二、TRPA1阻断对脑出血小鼠白质损伤的作用和机制研究目的探索脑出血小鼠中阻断TRPA1对白质损伤的作用及可能机制方法使用自体血注射模型在成年雄性C57BL/6小鼠(8-10周龄,22-30g)脑中进行脑出血造模。将小鼠随机分成以下7组:Sham,ICH,ICH+HC-030031,ICH+A-967079,ICH+polygodial,ICH+HC-030031预处理,ICH+A-967079预处理。采用免疫荧光(n≥3)、蛋白质印迹分析(n≥3)、透射电子显微镜(n=3)、电生理记录(n=3)、Kaplan-Meier生存曲线(n=8)和行为学测试(n=6)等方法,分析了荧光强度、灰度值、髓鞘评分、G值、运动诱发电位潜伏期、存活率和行为学分数等指标。结果1.免疫荧光和蛋白质印迹分析表明TRPA1在白质中表达并与MBP共标。2.TRPA1阻断剂HC-030031和A-967079缩短了脑出血小鼠第一天和第三天的运动诱发电位潜伏期。相比之下,应用TRPA1激动剂polygodial的脑出血小鼠没有诱导出运动诱发电位。3.在脑出血前三天,HC-030031和A-967079明显改善了BMS、爬杆平衡实验评分和前肢肌肉力量。4.脑出血小鼠使用HC-030031和A-967079后,在脑出血第一天和第三天NF200和MBP免疫荧光显著增强。MBP表达的增加表明HC-030031和A-967079减少了髓鞘骨架蛋白的降解。DMBP的荧光强度降低表明HC-030031和A-967079抑制了MBP降解。相反的是,polygodial加重了髓鞘损伤,表现为MBP荧光强度的降低,在脑出血第一天MBP表达的减少。5.透射电镜显示HC-030031和A-967079降低了脑出血急性期的脱髓鞘程度,表现为G值下降和髓鞘损伤评分的改善。此外,HC-030031可以改善轴突水肿,而应用polygodial的脑出血小鼠则有严重的髓鞘损伤和轴突水肿。6.脑出血后NOX1表达增加,在应用HC-030031和A-967079后观察到NOX1显著降低。在脑出血小鼠中Calpain1表达增加,在应用HC-030031和A-967079后其表达显著下调。结论上述研究结果表明:1)TRPA1阻断剂可显著改善脑出血小鼠前三天的神经传导功能和运动功能障碍;2)TRPA1在脑出血后的髓鞘损伤中起重要作用;3)NOX1和Calpain1的上调参与了TRPA1激活介导的髓鞘降解。