克罗诺杆菌（原阪崎肠杆菌）是一种能够引起新生儿及婴幼儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎等疾病的革兰氏阴性食源性致病菌。虽然由该菌引起的婴幼儿致病感染率较低，但死亡率却高达40～80％，而且幸存者可能遗留各种神经系统后遗症。国际食品微生物标准委员会将其定为“严重危害特定人群，威胁生命或导致慢性实质性后遗症”的细菌。传统的微生物培养方法检测克罗诺杆菌通常包括增菌培养、选择性富集培养、特异性鉴别培养和生理生化鉴定等步骤，灵敏性低、特异性差、费时费力，常常需要4～5天才能完成。因此，建立准确、快速的克罗诺杆菌检测方法对于食源性疾病的预防与控制具有主要意义。本研究首先对我国食品中克罗诺杆菌污染状况进行了初步研究，并对分离株进行了菌种鉴定和基因分型研究，然后建立了克罗诺杆菌实时荧光定量PCR和免疫磁珠-PCR快速检测方法并将其应用于食品样品的检测，旨在为食品中克罗诺杆菌的检测和监测提供技术支持。主要研究结果分述如下:　　1.食品中克罗诺杆菌分离及分离株的分类鉴定和抗生素敏感性研究。采用传统的微生物培养法和特异性PCR鉴定方法，对178份食品样品中克罗诺杆菌的污染状况进行了研究。结果从13份样品中检出为克罗诺杆菌，平均污染率为7.3％，其中谷物和香辛料中克罗诺杆菌的污染率分别为14.1％和4.5％，而其它食品样品均未检出克罗诺杆菌。利用常规的形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析及系统发育分析对13株克罗诺杆菌分离株进行了初步鉴定，结果显示所有克罗诺杆菌分离株均被鉴定为C.sakazakii。此外，本研究建立了基于rpoB基因序列分析及系统发育分析方法。结果表明该方法的分辨率高于传统的基于16S rDNA序列分析及系统发育分析方法。通过该方法对13株克罗诺杆菌分离株进行了分类鉴定，结果进一步证实13株克罗诺杆菌分离株均为C.sakazakii。　　2.基于rpoB基因的克罗诺杆菌real-time PCR快速检测方法的建立。以rpoB基因序列为靶序列，设计引物及探针，建立了一种基于rpoB基因的克罗诺杆菌real-time PCR检测方法。使用19株克罗诺杆菌和26株非克罗诺杆菌对real-time PCR检测方法进行了特异性检测，结果发现所有的克罗诺杆菌菌株均产生阳性扩增信号，而其他阴性对照菌株均未发现非特异性扩增信号。灵敏性试验结果表明real-time PCR检测方法对纯菌培养物和人工模拟奶粉样品的检出限均为102CFU/mL。经过12h增菌培养后，real-time PCR检测体系最低可检出样品中100CFU/mL(g)的克罗诺杆菌。此外，本研究建立的real-time PCR检测体系还具有较强抗干扰能力，即使在含108CFU/mL的肠炎沙门氏菌的样品中，其灵敏度也高达102CFU/mL。本研究建立的克罗诺杆菌real-time PCR快速检测方法具有灵敏度高，特异性好的优点，可用于食品中克罗诺杆菌的检测。　　3.阪崎克罗诺杆菌外膜蛋白OmpA基因的克隆、序列分析、融合表达及其分离纯化。以阪崎克罗诺杆菌CICC21560基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增出长度为1044bp的阪崎克罗诺杆菌OmpA基因。对OmpA基因编码的蛋白进行生物信息学分析可知，OmpA由347个氨基酸组成，预测分子量为37.1kDa。Blast序列比对结果表明阪崎克罗诺杆菌OmpA基因与克罗诺杆菌属其他种细菌的OmpA基因的序列相似性较高(95-99％)，而与其他肠杆菌科细菌的OmpA基因序列相似性较低(87～88％)。阪崎克罗诺杆菌OmpA蛋白序列与克罗诺杆菌属细菌相似性也较高(96～99％);其次为阴沟肠杆菌，相似性为93％;与鼠伤寒沙门氏菌、鲍氏志贺氏菌、大肠杆菌和产气肠杆菌OmpA蛋白序列相似性分别为91％、89％、89％和89％。这表明阪崎克罗诺杆菌OmpA蛋白具有一定的属内保守性，而与其他肠杆菌科细菌的OmpA蛋白的亲缘关系相对较远，可作为制备克罗诺杆菌属细菌的多克隆抗体和单克隆抗体的一种候选抗原。将OmpA基因片段亚克隆至表达载体pET-32a，成功构建了原核表达载体pET-32a-OmpA，将其转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，在IPTG的诱导下实现了融合蛋白OmpA的可溶性表达。SDS-PAGE电泳结果表明，通过镍离子亲合层析和Sephadex G-25分子筛层析等方法，本研究制备了纯度较高的OmpA蛋白，可用于后续试验的进一步研究。　　4.阪崎克罗诺杆菌OmpA蛋白多克隆抗体的制备及其免疫磁珠分离-PCR检测方法的建立。以纯化的阪崎克罗诺杆菌OmpA融合蛋白为抗原免疫新西兰大白兔，制备了阪崎克罗诺杆菌OmpA多克隆抗体。通过凝集反应和间接ELISA法测定了阪崎克罗诺杆菌OmpA多克隆抗体的特异性，结果发现该抗体能够与所有的克罗诺杆菌发生交叉反应。此外，该抗体还与大肠杆菌（Escherichia coli）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）和阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）有微弱的交叉反应，而与粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens），单增李斯特菌（Listeria monocytogenes），金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus），荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）没有交叉反应。通过硫酸铵沉淀法和Protein G亲和层析法对阪崎克罗诺杆菌抗血清进行了纯化，获得了浓度为5.0mg/mL，效价达到1∶80000的纯化抗体。将纯化的阪崎克罗诺杆菌OmpA多克隆抗体与Dynabeads(@)M-280Tosylactivated磁珠偶联，制备了阪崎克罗诺杆菌免疫磁珠。对抗体和磁珠的偶联条件进行了优化，确定偶联最佳反应条件为:抗体包被浓度为20μg/mL，偶联温度37℃，偶联时间12h。菌体与免疫磁珠最佳作用时间为30min。本研究建立的IMS-PCR检测方法对阪崎克罗诺杆菌纯菌培养物和人工污染奶粉的灵敏度均为5.2×102CFU/mL。经8h增菌培养后，IMS-PCR在PIF样品中最低可检出5.2×101CFU/mL的阪崎克罗诺杆菌。IMS-PCR检测方法可同时实现对6种克罗诺杆菌的检测，虽然免疫磁珠能够与少量的大肠杆菌，沙门氏菌和阴沟肠杆菌发生非特异性吸附，但是这并不影响IMS-PCR检测方法的准确性。IMS-PCR检测方法能够在12h内完成对食品样品中克罗诺杆菌的检测，为食品中克罗诺杆菌的检测提供了一种简便、快速的方法。　　5.实时荧光定量PCR和免疫磁珠分离-PCR快速检测方法在食品中的应用。为了评估实时real-time PCR和免疫磁珠分离-PCR快速检测方法的可靠性，并了解克罗诺杆菌在食品中的污染状况，本研究分别采用微生物培养法、real-time PCR和免疫磁珠分离-PCR快速检测方法对谷物食品、PIF、孕产妇奶粉和婴幼儿配方食品等4类70份食品样品进行了克罗诺杆菌检测，并通过属特异性PCR和16S rDNA序列分析方法对克罗诺杆菌分离株进行了验证。结果发现real-time PCR和IMS-PCR均从3份谷物食品（S5、S19和S29）、5份孕产妇奶粉（S39、S46、S48、S49和S50）及1份婴幼儿配方食品中(S66)检出了克罗诺杆菌，准确性达到100％，而微生物培养法则出现了漏检和假阳性现象。这表明本研究建立的real-time PCR和免疫磁珠分离-PCR具有较高的准确性，为食品中克罗诺杆菌快速检测研究奠定了基础。