研究目的:随着工业的发展,尤其是化工业的飞速发展,环境污染问题日益影响到人类的健康。环境污染物中有大量的物质具有类雌激素作用,称之为环境雌激素。环境雌激素的主要来源是人工化学合成的农药、化肥、生长剂及食品添加剂等。邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是邻苯二甲酸酯类化合物的一种,是塑料增塑剂的主要材料,同时也应用于化妆品、汽车玻璃、印刷油漆等行业,全球年消耗量在300-400万吨之间。邻苯二甲酸二丁酯在欧盟和美国都被列入可疑致畸物清单中,在化妆品、儿童玩具和保育用品中严格限制使用。邻苯二甲酸二丁酯具有雌激素样效应和抗雄激素作用。虽然其活力很低,但是人们接触到的机会大,所以生物体内的富集也较多。尤其是相关从业人员,其体内检测到DBP的量远远高于雌二醇的量。以往的动物实验证明DBP能够干扰体内的内分泌系统,从而对生殖系统造成损伤,还可能诱发激素依赖性的器官的肿瘤。其中研究比较多的是对雄性生殖系统的损伤,包括精子生成障碍、睾丸生精上皮发育明显异常、精曲小管变薄、萎缩、间质细胞异常增生等。然而目前DBP对雌性生殖系统的毒性研究报道却比较少。本研究在分离大鼠卵巢颗粒细胞并体外培养的基础上,建立邻苯二甲酸二丁酯染毒颗粒细胞模型,着眼于DBP对雌性生殖系统的损伤,具体来讲是DBP对卵巢颗粒细胞生长和分泌功能的影响,并进一步分析其对卵母细胞的成熟过程的影响以及DBP可能导致雌性动物生殖毒性的作用机理。研究方法:首先用孕马血清刺激大鼠,取卵巢分离出颗粒细胞,用台盼蓝染色、AKP染色和c-kit染色验证卵巢颗粒细胞。然后模拟DBP在生物体内的浓度建立DBP染毒卵巢颗粒细胞的模型。用CCK-8方法和克隆形成实验检测不同浓度的DBP对卵巢颗粒细胞的生长和增殖的影响。接下来检测了不同浓度的DBP对卵巢颗粒细胞分泌雌二醇E2和孕酮P的影响。进一步检测了雌二醇E2和孕酮P生成的两个关键酶P450芳香化酶和P450侧链裂解酶在不同浓度DBP处理下,分别用RT-q PCR和Western Blot方法检测其在m RNA水平和蛋白质水平的变化。最后用RT-q PCR和Western Blot方法检测了IGF-1和TNF-α这两个细胞因子的变化,考察不同浓度的DBP对卵巢颗粒细胞内细胞因子水平的影响。结果:本研究发现较低浓度的DBP长时间刺激卵巢颗粒细胞能够促进卵巢颗粒细胞的增殖,同时高浓度的DBP对卵巢颗粒细胞则发现有较明显的细胞毒性。DBP长时间处理卵巢颗粒细胞,可以提高其雌二醇E2和孕酮P的分泌,相对应的卵巢颗粒细胞内P450芳香化酶和P450侧链裂解酶在m RNA水平和蛋白质水平的表达量都有了提高。在DBP对卵巢颗粒细胞内细胞因子表达量的影响方面,本研究发现DBP能够明显提高IGF-1在m RNA水平和蛋白质水平的表达量,同时TNF-α的表达未见明显变化。结论:本研究揭示了,DBP长时间处理卵巢颗粒细胞可使其生长增殖模式发生改变,同时影响其分泌雌二醇E2、孕酮P的水平和P450芳香化酶和P450侧链裂解酶的表达水平。其机制可能是DBP诱导IGF-1表达增加,促进了P450芳香化酶和P450侧链裂解酶的活性,进而促进雌二醇E2和孕酮P的分泌。