目的:海马CA1区锥体神经元对于缺血性损伤特别敏感,并且在短暂前脑缺血后呈现迟发性死亡,而CA3和齿状回神经元则基本不受影响。在缺血再灌注过程,诱导产生了包括兴奋性神经毒、氧化应激、炎症等各种损伤反应。在缺血后极短的时间内,由于能量供应急剧减少,引起离子浓度的改变,以及细胞外谷氨酸及其它神经递质浓度的改变,这些因素启动了细胞死亡过程。但是如果缺血过程较为短暂,则细胞死亡主要表现为迟发性的神经元死亡。然而这种脑缺血后神经元迟发性死亡的机制尚未阐明。ephrinB2是Eph-ephrin受体配体系统的重要成员,生理状态下,ephrinB2在海马的CA1区锥体神经元的含量丰富,而在CA3区的神经元上含量较少,约为CA1区锥体神经元含量的1/10。ephrinB2与谷氨酸受体中的NMDA受体的功能活动有十分密切的关系。而NMDA受体的过度激活或者不受调控的活化在脑中风,脑创伤,正中颞叶性癫痫,帕金森,亨廷顿氏症以及阿尔兹海默病等许多急性和慢性的中枢神经系统病症中通过介导兴奋性神经毒性效应导致神经元死亡。然而,有关ephrinB2是否参与脑缺血再灌注损伤以及其作用机制如何,尚未见报道。MAPK信号转导通路通过不同的途径参与神经元的增殖、死亡等过程,其中报道较多的是细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2),它通过对靶蛋白如ephrinB2或其他下游信号分子的磷酸化,广泛参与了神经元存活和凋亡的调控过程,包括在缺血/再灌注损伤后神经元存活与死亡的调控。有报道显示ERK1/2的活化参与了脑缺血损伤,其磷酸化水平在脑缺血后增加,但也有报道p-ERK1/2在脑缺血再灌注后发挥了神经保护作用。因此目前关于ERK1/2在缺血损伤中的作用仍有争议。综上,本研究利用四血管夹闭短暂前脑缺血再灌注模型,免疫印迹技术、caspase-3、TUNEL细胞凋亡检测技术及在体给药技术,观察短暂前脑缺血后,成年大鼠海马锥体神经元p-ERK1/2、ephrinB2、NMDA受体等蛋白的表达变化,以观察ephrinB2在缺血再灌注损伤中的作用及可能机制。进而探讨脑缺血再灌注后海马CA1区锥体神经元发生迟发性死亡的机制以及产生海马CA1区和CA3区神经元损伤差异的原因。方法:1、短暂前脑缺血再灌注模型的建立采用改良的Pulsinelli四血管夹闭方法进行短暂前脑缺血(15 min)。手术前禁食过夜以恒定血糖水平。大鼠以水合氯醛麻醉(40 mg/100g,i.p.),颈部正中切口,分离双侧颈总动脉。然后将大鼠固定于定位仪上,电凝双侧翼小孔内的椎动脉,夜间禁食。以此方法制备的大鼠没有明显的脑损害,行为也如常。次日,用动脉夹夹闭完全清醒的大鼠双侧颈总动脉15 min造成严重短暂前脑缺血。大鼠在30～60 s内昏迷,翻正反射消失,双侧瞳孔放大,且观察眼球看到红色有明显变浅,痛反射消失,能自主呼吸。脑缺血15 min后解除动脉夹,恢复脑血流。具有这些症状的大鼠分别存活6 h、24 h或48h后进行相关实验。缺血后出现惊厥的大鼠予以排除,实验中保持大鼠体温37.0℃。给药组在灼闭椎动脉前先固定于大鼠立体定位仪上,头部正中切口,分离至颅骨,确定前囟点,以据前囟点向后0.8 mm,旁移1.3 mm,距颅骨面向下4.05 mm定位侧脑室,给予U0126 1ug(5ul),之后手术及缺血方法同单纯缺血再灌注组。2、实验分组(1)对照组(n=6);(2)缺血再灌注后6 h组、24 h组、48 h组(n = 6);(3)U0126+缺血再灌注后6 h组、24 h组、48 h组(n = 6);3、检测方法(1) TUNEL染色检测对照组、缺血再灌注组及提前给予ERK特异性抑制剂U0126缺血再灌注组的细胞凋亡检测。(2) Caspase-3酶活性的检测对照组、缺血再灌注组及提前给予ERK特异性抑制剂U0126缺血再灌注组的Caspase-3酶活性检测。(3) Western-blot对照组、缺血再灌注组及提前给予ERK特异性抑制剂U0126缺血再灌注组的ephrinB2、p-ERK1/2以及NMDA受体等磷酸化水平检测。4、统计学处理采用SPSS15.0统计软件分析数据。数据以均数±标准差(x±s)表示,成组设计的多个样本均数比较采用单因素方差分析(ANOVA),方差齐者组间比较用LSD检验,方差不齐者组间比较用Games-Howell检验,检验水准α=0.05, P<0.05认为有统计学意义。结果:TUNEL染色显示,随着脑缺血再灌注时间的延长,海马CA1区锥体神经元大量凋亡,在48 h凋亡比例达到80%以上;Caspase-3活性于缺血再灌注24 h达到高峰,48 h出现略微下降,而CA3区的神经元所受影响不大。Western blot结果显示,在缺血再灌注发生后,随着再灌注时间的延长p-ERK1/2、ephrinB2以及NMDA受体的磷酸化水平呈现快速增高的趋势,表明这些蛋白质参与了海马缺血再灌注后神经元的损伤过程。在脑缺血再灌注前预先给予p-ERK1/2特异性抑制剂U0126后拮抗了缺血再灌注所引起的海马神经元死亡,TUNEL染色及Caspase-3结果均显示海马神经元的存活有明显的改善。Western blot结果提示,提前给予U0126拮抗p-ERK1/2磷酸化的同时,抑制了ephrinB2的表达以及NMDA受体的活化(磷酸化),在48 h表达出现大幅下降,并且具有时间依赖性。在海马CA3区,TUNEL结果显示,CA3区的神经元基本不发生凋亡;western blot结果显示,在海马CA3区p-ERK1/2、ephrinB2、以及NMDA受体等蛋白表达及磷酸化水平与对照组相比均无统计学差异(P<0.05)。结论:1、在脑缺血再灌注中,ephrinB2参与了缺血再灌注所引起的神经元损伤;2、在脑缺血再灌注中,ephrinB2通过调节NMDA受体的活化参与海马CA1区锥体神经元的损伤;3、在脑缺血再灌注中,ephrinB2的活化受到ERK1/2的调节,即p-Erk1/2通过调节ephrinB2的表达参与缺血再灌注后海马神经元的损伤;4、在脑缺血再灌注中,缺少ephrinB2的CA3区神经元未见明显损伤,这可能是海马CA3区神经元很少出现死亡的因素之一。