南中国海红树林内生真菌抗菌活性研究

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红树林是生长在热带海岸潮间带的一种特殊植被,具有独特的生理和生态特异性,使得在该环境中栖息的微生物具有丰富的生物多样性。据报道,已经从红树林植物中分离到大量的细菌、真菌、放线菌等,并从它们的次级代谢产物中发现很多结构新颖的化合物。 我国南海海岸是我国红树林的重要分布区。本论文采集了广东省珠海市淇澳岛-担杠岛红树林自然保护区和广东省惠州市惠东县白沙村、巽寮湾等地的真红树林、半红树林和伴生红树林植物的茎、叶、花、果实等样品,采用添加海水的PDA培养基对这些样品中的内生真菌进行了分离,共分离到红树林内生真菌185株,其中在148株叶中分离得到,占总分离量的79.7%;20株在茎中分离得到,占总分离量的10.8%;从其他部位共分离到内生真菌17株,占总分离量的9.19%。经形态学的方法初步种属鉴定,这些内生真菌分别属于3纲、7目、10科、39属,表明这两个海域的红树林内生真菌具有丰富的多样性。 在对分离到的海洋红树林内生真菌进行形态学鉴别的基础上,本研究还采用电喷雾离子化(ESI-MS)的方法初步探讨了代谢组学在红树林内生真菌种属鉴别中的应用。 本论文还采用滤纸片法,以大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉为指示菌株,对分离自上述两个海域的185株内生真菌进行了抗细菌、真菌活性筛选,结果得到:其中96株内生真菌的培养液或菌体提取物至少对一种指示细菌有抑制作用,占总筛选菌数的51.8%;有71株内生真菌的培养液或菌体提取物至少对一种指示真菌有抑制作用,占总筛选菌数的38.4%。鉴于传统抗菌活性筛选方法存在费时、费溶剂的弊端。本论文建立了一种简单、快捷的微量提取方法用于抗菌活性筛选。我们采用L9(34)正交试验设计,以提取物重、抗白色念珠菌、抗金黄色葡萄球菌活性为考察指标,对微量提取法中的条件进行了研究。在主要考虑抗真菌活性的前提下,选择最佳的提取条件为:提取片数为6片、(二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇=2:3:1)混合溶剂做提取溶剂、超声提取三次、每次20分钟。在最佳提取条件下,采用单因素实验设计对提取片数和相关的提取物重量进行了研究,发现在提取片数为7片,稀释体积为400μL时可制的接近1mg/mL的筛选样品。并用微量提取方法对29株内生真菌的活性做了筛选,发现其中有6株对大肠杆菌有活性;1株对金黄色葡萄球菌有活性;3株对白色念珠菌有活性。筛选的阳性率与悬浮态发酵培养得到的筛选样品的阳性率相当。 LF4-7L是来源于湛江红树林植物中的一种内生真菌,经拓扑异构酶活性筛选发现其具有抗肿瘤的活性。本研究对内生真菌LF4-7L的次级代谢产物进行了研究,从中分离到两个单体化合物,经1H-NMR、13C-NMR、质谱等波谱学方法鉴别了结构,分别为镰刀菌酸A(Fusaric acidA)和甾醇。
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