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目的:G6PD缺陷症是常见的单基因遗传性酶缺陷病,目前尚无根治疗法,大规模人群筛查是目前预防疾病的主要手段,同时寻找新型治疗策略也是世界各国研究的重点。CRISPR/Cas9是一种新型基因编辑技术,具有安全性高、特异性强和精确可靠等优点,是一种极具临床应用价值的新技术。目前,利用CRISPR/Cas9技术治疗假肥大性肌营养不良、地中海贫血、血友病等单基因遗传病已在多个实验室开展。本文对重庆地区儿童进行G6PD酶活性和基因筛查,找出最具临床研究价值的突变位点;利用CRISPR/Cas9技术进行定点修复,为G6PD缺陷症治疗提供新策略。方法:应用多色探针熔解曲线法和G6PD/6PGD定量比值法分别检测G6PD基因突变和酶活性,找出突变频率高且G6PD酶活性低的突变位点。针对此位点设计两对sgRNA,构建PX458-G6PD-sgRNA重组质粒。转染HEK293细胞系后,分别在体内和体外采用T7核酸内切酶Ⅰ法(T7EⅠ)和用cas9蛋白酶法检测每对sgRNA的编辑效率。Sanger测序、G6PD/6PGD比值法、荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测CRISPR/Cas9定点敲除的单克隆细胞株的DNA序列、G6PD酶活性、mRNA和蛋白水平的变化。最后联合CRISPR/Cas9和单链寡核苷酸(ssODN)同源重组修复G6PD缺陷症。结果:通过sanger测序证实Cas9和sgRNA表达质粒PX458-G6PD-sgRNA构建成功;在体内用T7E1核酸内切酶法鉴定sgRNA1和sgRNA2的编辑效率分别为6.74%和12.36%;在体外用Cas9蛋白酶法鉴定分别为15%和17%。鉴定筛选出定点敲除G6PD基因1376G>T位点的HEK293单克隆细胞株,G6PD酶活性和mRNA水平显著下降。PX458-G6PD-sgRNA2质粒与ssODN共转染修复了1376G>T突变位点,G6PD酶活性、mRNA水平均恢复正常。结论:本研究首次对重庆地区儿童进行G6PD缺乏症的流行病学调査,掌握了本地区G6PD缺乏症的发病情况,发现1376G>T位点最具临床研究价值。CRISPR/Cas9通过同源重组定点修复了G6PD基因,为寻找G6PD缺陷症等遗传性血液病的新型疗法奠定理论及实践基础。