结合采用猪卵巢卵母细胞体外成熟(in vitro maturation, ⅣM)、体外受精(in vitro fertilization, ⅣF)和体外培养(in vitro culture, ⅣC)等技术,是体外生产(in vitro production, ⅣP)猪胚胎的主要方式。在实践过程中,卵巢运输、捡卵、卵母细胞处理和体外受精等,均需要一定的时间,难免会有温度的变化,不可避免地会产生冷应激反应。猪卵母细胞对低温的反应较为敏感,低温刺激可对猪卵母细胞的成熟质量,甚至受精后的发育能力产生不良影响。目前,大多关于冷应激影响卵母细胞和胚胎发育的报道,都是在动物个体水平进行的,例如对母猪进行冷应激处理；而在细胞水平进行冷应激处理,如直接处理猪卵母细胞,研究冷应激对其体外成熟等的影响,则少有报道；有关冷应激过程中亚细胞结构的变化及冷诱导RNA结合蛋白(cold inducible RNA-binding protein, CIRP)表达的研究在猪上尚未见报道。在冷应激条件下,细胞内大多数基因表达和蛋白质合成降低,细胞生长受到抑制,但冷休克蛋白(cold shock proteins, CSP)在冷应激条件下可大量表达。这类蛋白主要参与细胞基本功能的调节,对细胞产生一定的应激保护作用。CIRP是迄今为止在哺乳动物体内发现的少数冷休克蛋白之一。1997年,Nishiyama等首次从小鼠睾丸细胞中分离到CIRP的cDNA,并发现CIRP在细胞内具有冷应激保护功能。研究表明,CIRP在多种生物的细胞中呈组成型表达,具有基因调控作用,并伴随着冷应激刺激而过量表达。迄今已在非洲瓜蟾、牛蛙、大鼠、小鼠和人类的某些细胞类型,实验性证实CIRP在冷应激条件下的细胞保护作用,对理解人和动物冷应激调节机制具有重要的意义。推测猪卵母细胞在低温条件下,也会产生CIRP表达的变化,但其具体作用仍需要实验证明。本试验选用先前报道较多的32℃和室温25℃作为冷应激处理温度,研究冷应激对体外培养猪卵母细胞成熟率、受精率和发育能力的影响；研究冷应激处理对卵母细胞微管、微丝等亚细胞结构变化的影响；并通过荧光定量PCR检测CIRP mRNA的表达规律,初步分析其在冷应激条件下的细胞保护作用机制。试验内容和结果如下。1.冷应激对猪卵母细胞体外成熟与发育的影响抽吸法采集卵巢卵母细胞后,以38.5℃培养条件作为对照,试验组则分别在32℃和25℃环境温度下放置30 min,1 h和2 h。双醋酸荧光素(FDA)染色检查各组卵母细胞存活率,体外成熟培养44 h后根据第一极体(pbI)排出情况统计成熟率,成熟卵母细胞进行体外受精,比较各组体外受精卵裂率和囊胚发育率。结果表明,冷应激刺激后各组卵母细胞存活率未表现出显著差异；冷应激处理对卵母细胞成熟率和体外受精卵裂率的影响也不显著；32℃2 h(9.21%)和25℃2 h(9.71%)处理组的囊胚发育率明显下降(P<0.05),其他各组的囊胚发育率差异不显著(P>0.05)。2.不同保存液对卵母细胞冷应激处理后发育能力的影响室温(25℃)条件下,将猪GV期卵母细胞分别在TCM199培养液(不添加半胱氨酸、猪卵泡液和促性腺激素)和pFF(猪卵泡液)中放置0.5、2、6、12和24h,转至38.5℃培养44h,观察卵丘-卵母细胞复合体(COC)形态变化,统计卵母细胞成熟率、孤雌激活卵裂率和囊胚发育率,观察不同保存液对猪卵母细胞冷应激处理后体外发育能力的影响。结果显示,TCM199较pFF更有利于冷应激条件下猪卵母细胞的保存；冷应激处理后,pFF组卵丘细胞出现大量脱落,胞质颜色变浅；TCM199处理6、12、24 h后的成熟率(57.3%、58.0%和55.0%)较对照组(77.4%)有显著下降(P<0.05),而pFF处理6、12、24 h后的成熟率(51.1%、52.9%和48.8%)有极显著下降(P<0.01)。卵裂率除pFF 24 h处理组外无显著变化,但囊胚发育率变化较大,冷应激处理6、12和24 h组中,TCM199组囊胚发育率(11.4%、10.3%和12.1%)均较对照组(22.2%)有明显下降(P<0.05),而pFF组的囊胚发育率分别为4.4%、0%和0%(P<0.01)。3.猪卵母细胞冷应激条件下细胞骨架的变化对猪GV期卵母细胞进行不同温度(32℃和25℃)和不同时间(0、0.5、1和2 h)的冷应激处理,体外成熟培养44 h,收集成熟卵母细胞,应用免疫荧光染色和激光共聚焦显微成像技术,观察温和低温刺激对卵母细胞染色体、纺锤体及微丝形态结构变化的影响。结果表明,卵母细胞亚细胞结构变化与冷应激时间有关。32℃2 h和25℃2 h组染色体、纺锤体正常比例(51.43%和53.57%)显著低于对照组(77.17%；P<0.05),其余各组差异不显著(P>0.05)。25℃2 h组微丝正常比例(76.78%)较对照组(90.22%)有显著下降(P<0.05),其余各组差异不显著。4.冷应激对猪卵母细胞CIRP表达的影响猪GV期卵母细胞于32℃分别放置0、0.5、1、2、4、6、8、10和12 h,用荧光定量PCR检测CIRP mRNA表达的变化,并比较不同冷应激温度(32℃2 h与25℃2 h)间的表达差异。结果显示,冷应激可使猪卵母细胞CIRP mRNA表达水平显著升高(P<0.05),且在一定范围内随冷应激时间的延长和温度的降低而增加,32℃处理4 h时其表达量最大,超过4h后随冷应激时间的延长而逐渐降低；冷应激处理2 h时,25℃时CIRP mRNA表达较32℃略有降低,但无显著差异(P>0.05)。5.CIRP在猪卵母细胞冷应激反应中的作用猪GV期卵母细胞在32℃冷应激条件下处理0、2和6h,检测各组卵母细胞CIRP、Bcl-2和SOD-1 mRNA表达的变化,分析冷应激条件下CIRP mRNA表达与Bcl-2和SOD-1 mRNA变化的关系。结果表明,CIRP mRNA表达与Bcl-2和SOD-1 mRNA表达间存在有相关性,Bcl-2和SOD-1 mRNA表达量随CIRP mRNA的升高而升高；CIRP mRNA表达降低时,Bcl-2和SOD-1 mRNA的表达也随之下降。表明冷应激条件下CIRP的表达可能直接影响细胞抗凋亡、抗氧化能力。