研究背景:肝母细胞瘤(Hepatoblastoma,HB)是一种特殊的儿童肝癌,在儿童所患肿瘤中占有重要的地位,在世界范围内发病率越来越高,尤其是在北美和欧洲。HB主要来源于人类未成熟的肝前体细胞。根据组织学分类,这种肿瘤可分为上皮源性或混合型上皮/间充质组织源性。肝母细胞瘤的治疗方法有辅助化疗、放疗、移植等。虽然人们在治疗这种肿瘤方面取得了部分进展,但效果仍不明显。随着生物技术的发展,基因治疗在抗癌方面的作用受到越来越多的关注。Long Non-coding RNA(lncRNA)在肿瘤研究中发挥着重要的作用,它们影响肿瘤生物学活性的各个方面,如转录、表观遗传和调控mRNA表达。它们可以通过与人类癌症中的miRNA或mRNA相互作用形成通路。例如,lncRNA-MUF与ANXA2和miR-34a相互作用,使间充质干细胞不能诱导肝癌发生;LncRNA HNF1A-AS1介导的miR-34a/SIRT1/p53轴促进结肠癌转移进展等。本文选取lncRNA OIP5-AS1进行研究。一些研究表明,LncRNA OIP5-AS1在某些疾病中具有调节作用可以调节生物活性。例如,它可以通过抑制GAK表达控制有丝分裂等,以调控多发性骨髓瘤细胞的增殖和凋亡。。在人类癌症中,microRNA是一些非常重要的生物标志物。它们能够成为各种人类癌症的肿瘤促进剂或肿瘤抑制剂。已有研究表明miRNA可通过靶向下游mRNA的种子区,通过抑制mRNA的翻译来发挥miRNA的抗癌作用。例如,以 FAM83D为靶点的 has-miR-495 在结肠直肠癌(carcinoma of colon and rectum:CRC)中作为肿瘤抑制因子。MiR-186-5p是一种miRNA,其具体的生物学行为在肝母细胞瘤中尚未见报道。本文就其在肝母细胞瘤中的抗肿瘤作用进行了深入探讨。锌指E-box结合同源异构体1(ZEB1)是一种转录因子,已被证实具有丰富的致癌特性。ZEB1以前曾报道在许多类型的人类癌症中高度表达,如结肠癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。已发现其也参与肝细胞肝癌(HCC)、甲状腺癌(TC)、结直肠癌(CCAR)等的ceRNA模式。这些前期的报道都有助于我们进一步的研究。通过以上报道和介绍,我们了解了 lncRNA、miRNA和mRNA的重要性。CeRNA模式是由三种基因组成的生物轴。例如,lncRNACCAT1作为ceRNA在骨髓瘤中调节 miR-181a-5p/HOXA1 轴;NSCLC 中 MALAT1-miR-124-STAT3 通路。在本研究中,我们在HB中探索了一个ceRNA通路来研究LncRNA OIP5-AS1/miRNA-186-5p/ZEB 1(mRNA)轴的功能。在对前期临床及组织芯片所得数据进行整理后,探究临床肝母细胞瘤患者中LncRNA OIP5-AS1的表达与肿瘤的TNM分期、肝癌细胞增殖、转移和上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)等过程的相关性,探究LncRNA OIP5-AS1与miRNA-186-5p及上皮-间充质转化关键分子(Epithelial-Mesenchymal Transition Transcription Factors,EMT-tfs 之间 的关系,而这将进 一步阐明ceRNA模式在肝母细胞癌中影响在肿瘤细胞侵袭-转移机制,为肝细胞癌转移的诊断与治疗提供新的理论基础,为临床个体化治疗提供思路。实验目的:本实验基于肝母细胞瘤临床及组织芯片数据,通过敲减lncRNA OIP5-AS1,探究其是否可以通过miR-186-5p/ZEB1信号轴,进而在肝母细胞瘤细胞中以ceRNA模式对增殖,侵袭转移和上皮-间充质转化过程(EMT)进行调控。实验方法:1.实时定量PCR法检测80例肝母细胞瘤患者组织标本(80例癌组织与80例癌旁正常组织相匹配)、利用q-PCR技术探究人正常肝细胞系L-02、QSG-7701,肝母细胞瘤细胞系 SMMC-7721、HepG2、HuH-6 细胞中 lncRNA OIP5-AS1的表达情况。探究其表达量与肿瘤的TNM分期、肝母细胞瘤增殖、转移和上皮-间充质转化EMT等过程相关。2.构建并转染lncRNA OIP5-AS1的敲减质粒,选取HepG-2、HuH-6细胞系中敲低OIP5-AS1后,通过q-PCR检测细胞内OIP5-AS1的表达,利用划痕实验、克隆形成实验、侵袭实验、Transwell小室实验检测细胞转移侵袭、增殖能力,通过Western Blot检测EMT相关蛋白的表达。3.构建敲除lncRNAOIP5-AS1的HuH-6/sh-OIP5-AS1细胞系,通过生物信息学预测的方式找寻下游的靶标mircoRNA miR-185a-5p,并在Linux系统中模拟两者间的碱基结合能力及结合位点。4.利用核浆分离实验,探究lncRNAOIP5-AS1在HepG2、HuH-6细胞中的具体表达位置,同时利用实时定量PCR验证、双荧光素酶报告实验和碱基配对关系预测分析探究lncRNA OIP5-AS1与下游靶标miR-186-5p的结合能力和两者间的调控关系,并利用挽救实验加以验证。5.利用几个常用的miRNA数据库,我们找寻了 miRNA-186-5p的靶基因ZEB1,并利用与第四步中同样的方法,探究miRNA-186-5p与下游靶基因ZEB1的结合能力和两者间的调控关系,并利用挽救实验加以验证。并利用实时定量PCR再次验证了 lncRNA OIP5-AS1与ZEB1间的调控关系6.利用miRNA-186-5p的干扰质粒和si-ZEB1的敲减质粒,在已构建的敲除lncRNA OIP5-AS1 的 HuH-6/sh-OIP5-AS1 细胞系中,验证了LncRNA OIP5-AS1/miRNA-186-5p/ZEB 1(mRNA)轴的功能。7.最后通过Western Blot再次检测了第五步中各个处理过程中EMT相关蛋白的表达情况,以验证lncRNA OIP5-AS1是可以通过miR-186-5p/ZEB1信号轴,进而在肝母细胞瘤细胞中以ceRNA模式对肿瘤细胞的增殖,迁徙和侵袭-转移过程(EMT)进行调控。实验结果:1.LncRNA OIP5-AS1在肝母细胞瘤组织和细胞系中呈现高表达状态,并与临床患者的多种临床指标间存在明显的相关性,Kaplan-Meier生存曲线的结果表明,与低表达组相比,高表达组具有更短的存活时间和更低的存活率,lncRNA OIP5-AS1高表达提示肝母细胞瘤患者预后不良。2.在肝母细胞瘤细胞系HepG2、HuH-6中敲除lncRNA OIP5-AS1后,细胞的增殖,转移和上皮间-充质转化(EMT)过程会受到明显的抑制。3.在肝母细胞瘤中,lncRNAOIP5-AS1与miR-186-5p间可以通过碱基配对的方式进行结合,同样的miR-186-5p也同样可以通过碱基配对的方式与ZEB1之间进行结合,进而形成ceRNA调控模式。4.肝母细胞瘤中可能存在 LncRNA OIP5-AS1/miRNA-186-5p/ZEB 1(mRNA)信号轴,通过lncRNAOIP5-AS1,miR-186-5p和ZEB1表达量的调控,进而在HB细胞中以ceRNA模式对肿瘤细胞的增殖,迁徙和侵袭-转移过程(EMT)进行调控。结论:1.在肝母细胞瘤中,lncRNA OIP5-AS1的高表达状态提示肝母细胞瘤患者预后不良。2.lncRNAOIP5-AS1是可以通过miR-186-5p/ZEB1信号轴,进而在肝母细胞瘤细胞中以ceRNA模式对肿瘤细胞的增殖,迁徙和侵袭-转移过程(EMT)进行调控