仔猪腹泻是目前最严重的仔猪疾病之一，也是引起仔猪死亡的重要原因之一。在传染性因素中，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)是造成仔猪腹泻的主要病原。二者在病毒形态、流行病学、病理剖检等方面均极其相似。传统的诊断方法如病毒中和实验、免疫荧光抗体实验等虽然对于TGEV和PEDV的检测防治起到了重要作用，但也存在特异性不强、灵敏性差、耗时长、难以检出微量病毒、不适宜早期诊断等缺点。随着生物技术的发展，更多的研究集中于分子生物学诊断方法。本研究主要建立猪Ⅰ型冠状病毒多重RT-PCR及间接ELISA的检测方法，为临床及时诊断、有效防治两种疾病奠定基础。　　 本研究利用DNA sis2.0对TEGV及PEDV进行序列分析，选取TGEV ORF2(S基因)和PEDVORF6(N基因)的基因序列保守区域，经Primer Premier5.0软件设计合成两对引物，建立了猪Ⅰ型冠状病毒的多重RT-PCR诊断方法。通过扩增产物大小以及与测序结果比对，证实该方法的准确性；使用猪伪狂犬病毒(PRV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪瘟病毒和猪轮状病毒的RNA作为模板，检测该方法的特异性；同时通过逐级稀释三联疫苗的浓度，检测该方法的敏感度。使用建立的多重RT-PCR方法对来自各地的28份临床病样进行检测。结果表明多重RT-PCR扩增得到与预期大小相一致的约858bp和511bp的产物，扩增产物测序后与原序列比对有97％以上的相似性；特异性试验表明，多重RT-PCR不与猪伪狂犬病毒(PRV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪瘟病毒和猪轮状病毒反应，特异性良好；敏感性试验表明多重RT-PCR能检测1 pg总RNA；临床病样检测结果表明病毒性腹泻所占比率达到78.57%(22/28)，TGEV和PEDV混合感染病料2两份，感染TGEV和PEDV的病料分别为3份和18份，非病毒性腹泻病料6份。　　 收集各地区腹泻病样，处理后接种Vero-E6细胞，盲传，分离PEDV。制作兔抗三联疫苗的多克隆抗体，使用分离的PEDV病毒建立免疫荧光试验(IFA)。结果表明根据细胞病变初步鉴定分离出的PEDV，使用单一RT-PCR的方法进一步鉴定，扩增产物经测序比对确定分离出病毒为PEDV；IFA试验能有效鉴定出PEDV。　　 参考NCBI上公布的TGEV与猪呼吸道冠状病毒(PRCV)S基因序列，选定TGEV-H株S基因序列中保守的D、A抗原位点和易缺失的B、C抗原位点、PEDVCV777株S基因S1区作为目的片段，将3个片段分别克隆到pET-32a(+)载体，构建的重组载体转化到E.coli BL21(DE3)中进行原核基因表达。三种重组原核表达蛋白经Nj2+纯化后，采用Western blotting的方法进行免疫原性验证。随后利用表达和纯化的重组蛋白进行了间接ELISA试剂盒的初步研究。结果表明克隆的T-DA、T-BC和P-S1基因在E.coli BL21(DE3)中有效表达，重组蛋白纯化后经Western blotting验证表明其均具有良好的免疫原性。间接ELISA初步研究结果显示：试验摸索出重组蛋白T-DA和重组蛋白P-S1最佳包被浓度分别为3.125×10-5 mg/mL和4.16×10-5 mg/mL、而重组蛋白T-DA和重组蛋白P-S1的最佳血清稀释度均为14000倍稀释、最佳封闭液均为1% BSA+2% NaCl+0.05% Tween-20，为ELISA试剂盒的开发打下了良好的基础。