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沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)p ORF5(pgp3)是由质粒基因编码的唯一一种分泌到宿主细胞胞浆中的分泌性质粒蛋白,与毒力密切相关,但p ORF5在Ct致病过程中的分子机制和功能还不甚明了。本研究试图探讨在Ct致病过程中与质粒蛋白p ORF5相互作用的宿主蛋白及其功能,为深入研究Ct的致病机制提供实验依据。构建p ORF5基因慢病毒表达载体,与辅助质粒共转染HEK 293T细胞包装慢病毒颗粒,收集慢病毒后感染He La细胞,流式细胞技术多次分选筛选阳性细胞克隆,获得p ORF5基因稳定转染的He La细胞系(p ORF5-He La细胞系)和对照He La细胞系,实时定量PCR(q RT-PCR)和Western blotting分别鉴定p ORF5的m RNA和蛋白表达水平。采用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术结合二维液相色谱串联质谱(2DLC-MS/MS)技术建立p ORF5-He La细胞系和对照He La细胞系的全细胞蛋白表达谱,构建差异蛋白表达数据库;q RT-PCR验证部分差异蛋白m RNA的表达水平。应用DAVID在线生物信息学分析软件、在线STRING软件分析和在线KEGG PATHWAY Database软件分析等生物信息学方法对差异蛋白进行GO(基因本体)分子功能注释、蛋白质相互作用及KEGG信号通路分析,预测差异表达蛋白生物学功能。构建高迁移率族蛋白B1(HMGB1)基因RNAi慢病毒表达载体,利用三质粒慢病毒包装系统生产sh RNA-HMGB1病毒,收集病毒上清,并感染He La细胞,建立稳定干扰HMGB1表达的p ORF5-He La细胞系及空白载体转染的对照细胞系;采用q RT-PCR和Western blotting检测自噬相关蛋白Beclin-1和LC-3的表达;采用流式细胞仪检测检测细胞凋亡率和细胞周期。本实验研究结果如下:1.成功建立了稳定过表达p ORF5的He La细胞系和对照细胞系;2.采用i TRAQ标记结合2D LC-MS/MS质谱技术共鉴定了314个差异表达的宿主蛋白,其中159个蛋白表达上调,155个蛋白表达下调。GO功能注释显示:差异蛋白的功能主要涉及分子功能、细胞组分功能和生物学进程功能三方面。分子功能方面包括:①蛋白结合转录因子功能,如核仁磷酸蛋白、RNA聚合酶Ⅱ激活因子p15等;②核酸结合转录因子功能,如高迁移率族蛋白B1、高迁移率族蛋白B2等。细胞组分功能方面包括:①参与细胞分裂增殖,如氯离子通道蛋白1、膜联蛋白A1等;②参与细胞连接,如α-辅肌动蛋白-4、整合蛋白α-6等。在生物学进程功能方面:部分差异蛋白参与细胞繁殖过程,如运铁蛋白受体蛋白-1、60S酸性核糖体蛋白P2等;部分差异蛋白参与细胞免疫反应过程,如补体C9、补体衰退加速因子等;部分差异蛋白参与细胞死亡,如角蛋白、抑制蛋白-1等。STRING软件分析结果显示:各差异表达蛋白之间存在着直接和间接的相互作用。KEGG通路分析结果显示:差异蛋白与多条信号通路相关,主要涉及了核糖体通路、剪接体通路、ECM受体相互作用通路、MAPK信号通路和p53信号通路等;3.q RT-PCR证实p ORF5-He La细胞中PARK7、HMGB1、HMGB2、HBA1和HIST1H1C表达上调,CDKN2A、SFN、KRT7、CLIC1表达下调,Western blotting进一步验证HMGB1和PARK7蛋白质在p ORF5-He La细胞表达水平升高,与蛋白质组学结果一致;4.与对照细胞比较,稳定干扰HMGB1的p ORF5-He La细胞的自噬蛋白Beclin-1和LC-3m RNA表达明显降低,分别降低了62%和89.8%。Western blotting结果显示,与对照细胞比较,稳定干扰HMGB1的p ORF5-He La细胞自噬相关蛋白Beclin-1明显下降;LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ比率小于对照组,LC3-Ⅱ表达降低。流式细胞仪检测结果显示稳定干扰HMGB1的p ORF5-He La细胞的凋亡率明显增加,增加了18.84%;细胞周期也发生了改变,G2和S期细胞分别增加了4.44%和3.4%。本实验研究结果表明:1.成功构建p ORF5所引起的宿主差异表达蛋白数据库,鉴定到差异蛋白314个,其中上调159个,下调155个,与细胞免疫反应、生物调节、生物粘附有关;2.p ORF5可通过上调宿主蛋白HMGB1,诱导细胞自噬、抑制细胞凋亡。