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疫苗接种一直是各个国家防治传染病的重要手段,因此疫苗接种不仅要增强机体的免疫应答能力,而且要安全,副作用降至最低。细胞因子是机体的自身物质,相比传统佐剂作为免疫增强剂具有更多优势。IL-4 对免疫应答的影响主要是抑制细胞免疫,促进体液免疫,特别是IgE 介导的免疫应答反应,是IgE 的特异性诱导剂。IL-6 是由多种细胞产生的具有多种生物功能的细胞因子,它能够刺激B细胞的分化和免疫球蛋白的产生,亦能刺激产生细胞毒型T 细胞。国内外对猪IL-4 和IL-6 在增强人畜共患的猪囊尾蚴病的免疫应答反应研究甚少,因此本实验进行了两个基因的克隆、表达及其疫苗佐剂效应研究。 首先,以植物血凝素(PHA)和脂多糖(LPS)共同刺激从猪脾脏和淋巴结分离的淋巴细胞,提取总RNA,采用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增IL-4、IL-6 基因,将扩增到的基因分别与pGEM-T-easy 载体连接后进行酶、PCR 以及测序鉴定,结果表明:所克隆到的IL-4 基因,与NCBI/GenBank 上登载的序列进行对比,序列同源性达99%,序列全长416 bp,开放阅读框架(ORF)长为402 bp,编码133 个氨基酸残基的前体蛋白,分子量约为15 ku;克隆到的IL-6 与NCBI/GenBank 上登载的序列进行对比,序列同源性达99.7%,其ORF 长为639 bp,共编码212 个氨基酸残基的前体蛋白,分子量约为24 ku。 第二,根据克隆的IL-6 基因阅读框序列,去掉信号肽后,设计pIL-6 表达引物,以重组质粒pGEM-T-easy/IL-6 为模板进行扩增,扩增产物与pGEX-4T-1 进行连接后转化大肠杆菌,经酶切、PCR 和测序鉴定,表明IL-6 成功插入到pGEX-4T-1 中。用IPTG诱导融合蛋白表达,经RT-PCR 检测发现555 bp 的特异性条带,表明IL-6 基因在大肠杆菌中得到了正确转录。重组菌在42℃诱导后以包涵体形式表达了猪IL-6 蛋白,经SDS-PAGE 分析,在47 ku 处出现融合蛋白条带,占菌体蛋白33%。并对其进行分离、变性、纯化和复性,纯度达到90%以上。用包涵体复性蛋白注射小鼠,毒性和活性检测结果初步揭示该蛋白较安全,能提高小鼠的免疫抵抗力;通过改变诱导条件和培养温度,实现了IL-6 的可溶性表达,并用GST 纯化层析柱纯化,纯化率达到95%以上。用MTT法检测可溶性表达蛋白的生物活性,结果表明随蛋白浓度的增加其细胞增殖程度也相应增加,与对照组相比,差异显著。