恶性肿瘤已成为目前危害人类身体健康最严重的疾病之一。外科手术,化疗,放疗等传统的各种治疗手段都存在不同程度的缺陷,电化学疗法在通过电场作用增加细胞或肿瘤组织的透化作用的情况下,降低用药量的同时提高了治疗效果,但仍不能完全避免药物对机体的毒副作用。纳秒级脉冲电场刺激(nsPEFs)是一种杀伤肿瘤细胞的新方法。已有的研究表明,nsPEFs可以在多种类型的细胞中作用于细胞膜结构并对凋亡信号产生诱导作用从而导致细胞凋亡。但具体的作用机制,作用部位以及凋亡通路还不明确。在本文的研究中,我们用场强为10kV/cm,脉宽为500ns,频率1Hz的脉冲电场对人肝癌细胞HepG2施加不同时间的刺激,通过细胞凋亡效率检测,形态学观察,细胞膜的通透性、线粒体跨膜电位的变化,及细胞内的凋亡相关因子和钙离子的研究来探索电场的生物学效应及可能的凋亡机理。以期为癌症特别是肝癌的脉冲电场治疗或其他的相关研究提供理论依据和参考。主要的研究内容和结果如下:　　①分别对细胞施加0、10、20、30及60个脉冲电场刺激后,用AnnexinV-FITC和PI双染的方法结合流式细胞技术进行凋亡率检测。结果表明,随着刺激时间的增加,细胞凋亡比例也随之增加,nsPEFs在诱导肝癌细胞HepG2早期凋亡方面具有明显效果。　　②通过透射电镜对经过脉冲电场刺激后的实验组细胞和未经电场刺激的对照组细胞进行形态学观察,发现经过电场刺激后的细胞,出现了如核仁消失,核染色质固缩、核膜皱褶甚至消失的现象,出现凋亡小体等典型的细胞凋亡形态学特征。结果表明电场刺激能够诱导细胞凋亡,且随着电场刺激时间的增加,凋亡效果呈增长趋势,但120s的电场刺激会导致细胞大量溶解性坏死。　　③通过碘化丙啶(PI)探针对细胞进行染色,结合荧光倒置相差显微镜对电场刺激后的细胞膜通透性(电穿孔)进行观察发现:施加电场能量越高,细胞“穿孔”越快,比例越大。同时,本文通过对这种nsPEFs引起的“穿孔”是否恢复的实验检测,结果显示,到电场刺激后4h,PI红色荧光还非常强,细胞穿孔未见明显恢复,因此,本文所用的脉冲电场刺激诱导HepG2产生的“穿孔”是不可逆的。　　④通过罗丹明123对细胞进行染色,结合激光共聚焦显微镜对电场刺激后的细胞线粒体膜电位进行实时观测,结果显示:细胞受到脉冲电场刺激后的几秒钟内即出现线粒体膜电位下降的现象,但两个实验组(20s,60s)之间没有明显差别。接下来通过JC-1荧光探针结合荧光光谱仪对电场刺激后的细胞膜电位进行检测,分别在电场刺激后1h,2h和4h检测结果,各时间点检测结果显示:细胞受到电场刺激后,随着刺激时间的增加,线粒体膜电位呈下降趋势,且20s组和60s组相对于对照组均有显著性差异。但随着时间的推移,各实验组细胞线粒体膜电位呈向正常水平恢复的趋势,到4h的时候,20s实验组细胞的线粒体膜电位已临近正常水平。　　⑤通过Fluo-3AM探针对细胞染色,结合激光共聚焦显微镜对不同时间(20s、60s)脉冲电场刺激后的细胞胞内钙离子浓度进行实时观测结果显示:nsPEF刺激能诱导胞内钙库释放钙离子,胞内钙离子浓度迅速增加,峰值分别达到刺激前的3.192倍(20s)和1.746倍(60s)。通过荧光光谱仪对电场刺激后的细胞胞内钙离子检测发现,1h后胞内钙离子水平已基本达到稳定状态,20s组细胞胞内钙离子浓度恢复至正常水平,而60s电场刺激后的细胞样品,胞内钙离子浓度明显高于对照组和20s刺激组。表明不同参数的电场刺激可影响胞内钙离子的响应。　　⑥通过实时定量PCR和western-blot的方法对电场刺激后的细胞凋亡相关因子的变化进行了检测,结果显示:随着实验中刺激时间的增加,各因子在RNA水平上呈上升趋势;通过western-blot方法对相关蛋白检测后发现,细胞凋亡通路上的caspase8、Bak、Bax和caspase6随着刺激时间的增加,蛋白浓度呈上升趋势,而caspase-12未见明显变化。　　综合实验结果,初步确定脉冲电场刺激诱导肝癌细胞凋亡是通过线粒体凋亡通路实现的。