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沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, Ct)有19个血清型,可引起人类多种疾病,Ct感染眼部,引起沙眼和慢性滤泡性结膜炎,导致翳痕和眼盲。WHO统计全球约有5亿人感染沙眼,其中900万人致盲,是引起失明的主要感染因素,在发展中国家多见。Ct还可引起尿道炎、宫颈炎、输卵管炎等泌尿生殖系统的感染,在发达国家性传播疾病已成为人类健康的重大问题,人们试图通过接种疫苗来控制研制Ct感染,由于Ct培养困难,基因Ct工程疫苗已成为人们关注的热点。在感染性原体(elementary body,EB)表面暴露的抗原是保护性抗体的靶标。研究最多的表面抗原是具有免疫原性的主要外膜蛋白(major outer membrane protein, MOMP),它是已知中和抗体的靶位。MOMP特异性抗体在体外通过封闭EB粘附来中和Ct的感染,但用MOMP疫苗接种或MOMP单克隆抗体注射噬齿类动物仅有部分免疫保护作用,并且作用是短期的,因此MOMP不是最理想的候选抗原,人们已在寻找Ct表面其它中和抗体的靶位。衣原体多形态膜蛋白D(Polymorphic membrane protein D, PmpD)是近年来被认识的位于Ct表面、分子量约为155kD的一种膜蛋白,能被由Ct引起的性病淋巴肉芽肿、宫颈炎、尿道炎和沙眼病人恢复期血清识别,其抗血清能特异识别所有血清型Ct,但不识别鼠衣原体(C. muridarum)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae, Cpn)或豚鼠衣原体(C.caviae)。用地鼠肾细胞(Hak)进行中和试验,PmpD特异性血清能中和所有Ct血清型的感染,表明PmpD具有Ct泛中和性位点,理论上能对所有血清型Ct提供保护作用。本研究根据NCBI公布的Ct PmpD基因序列设计引物,用Ct L2基因组作为模板,PCR扩增获得PmpD核心基因序列。经1%琼脂糖凝胶电泳分析,扩增产物大小约为2250bp,与理论值相符。扩增产物经限制性内切酶Nco I和Sal I双酶切后与同样双酶切的pET32a片段构建表达质粒pET32a-PmpD,转化BL21(DE3)感受态细胞得到表达工程菌株,该菌株经过PCR快速筛选、Nco I和Sal I双酶切鉴定和序列测定并与已知序列比对可知,插入目的片段开放读码框正确,其一致率99%,仅在第1936位碱基突变,由G突变成A。重组Ct PmpD (rCt-PmpD)融合了硫氧还蛋白,其分子量为116kD。优化了工程菌株的表达条件,当IPTG终浓度为1mM,37℃诱导5hr,可获得以包涵体形式表达的rCt-PmpD,表达量可达菌体含量的10%。经超声破碎、洗涤,可以获得较纯的包涵体,SDS-PAGE分析rCt-PmpD纯度可达85%。纯化后的rCt-PmpD包涵体用8mol/L尿素溶解变性,放入含100mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA、0.2mol/L盐酸精氨酸、尿素2mol/L,0.004mol/L氧化型谷胱甘肽及0.002mol/L还原型谷胱甘肽的透析溶液中复性,4℃放置24hr后,蒸馏水透析24hr。免疫印迹实验中rCt-PmpD与Ct L2免疫兔血清出现特异性沉淀线,说明其具有较好的抗原性。用复性的rCt-PmpD免疫家兔制备血清,该血清在间接免疫荧光实验中能特异性识别Ct L2。用该血清与Ct L2体外孵育后接种鸡胚,可有效地保护鸡胚免于死亡,说明rCt-PmpD特异性抗体具有中和活性。综上所述,本研究已成功地构建重组表达载体pET32a-PmpD,表达的rCt-PmpD具有较好的免疫原性,rCt-PmpD的免疫兔血清具有免疫保护性,为进一步研制Ct亚单位疫苗奠定了基础。