钛及其合金材料,因其良好的机械性能,抗腐蚀性和生物相容性,在临床上被广泛应用于人体各个部位骨缺损的修复。然而,由于钛的弹性模量与天然骨组织相差较大,实心钛种植体在行使一段时间功能后容易引起周围骨组织因为应力屏蔽导致吸收,最终引起种植体的松动或脱落。为了避免这一现象的发生,我们可以构建多孔样的骨修复材料,这样一方面降低了材料整体的弹性模量,另一方面形成的孔洞结构还可以引导骨组织长入形成更牢固的嵌合结构。本课题拟从这一角度出发,结合3D打印技术,探索构建不同结构的三维多孔样Ti6Al4V植体,并通过表面改性的方式试图优化其成骨功效。第一部分多孔化钛合金骨修复材料的构建及表面改性[目的]制备多孔Ti6Al4V骨修复材料并评价其机械学性能;在材料表面构建纳米管样,载锶纳米管样涂层。采用EBM制作多孔钛合金支架;采用万能材料试验机检测支架的机械强度;采用Micro-CT扫描分析支架的几何学参数;采用阳极氧化在材料表面形成纳米管样结构;采用阳极氧化结合水热载锶处理在材料表面形成载锶纳米管样结构;采用FE-SEM观察材料表面的形态;采用EDS检测材料表面的元素分布;采用ICP-AES检测载锶纳米管样钛合金支架的锶元素释放曲线;采用接触角测量装置检测多孔支架的亲水性。[结果]通过EBM成功制备出600μm,800μm两种不同孔径的多孔Ti6Al4V支架,其压缩强度分别为205.06 MPa和114.98 MPa,杨氏模量为4.51 GPa和3.11 GPa;Micro-CT显示其实际几何参数与设计参数接近;FE-SEM显示未处理材料表面无特殊结构,粗糙平坦,阳极氧化处理后形成均匀的纳米级管阵列样结构,进一步的水热处理使得纳米管壁明显增厚;EDS显示未处理表面元素为Ti,O,Al,V,纳米管样表面为Ti,O,Al,V,F,载锶纳米管表面为Ti,O,Al,V,F,Sr;ICP-AES显示Sr可维持长达30天的释放,且600μm试样Sr释放量略高于800μm组;亲水性实验显示未处理组疏水,液滴停留在材料表面,而纳米管组和载锶纳米管组亲水,液滴瞬间渗透进入多孔支架内部。[结论]EBM可以制备出特定的多孔Ti6Al4V支架,具有良好的制作精度;两种不同孔径的Ti6Al4V支架材料均有一定的机械强度,且其弹性模量也与正常人体骨组织接近;通过阳极氧化的方式可以在多孔支架的表面形成均匀纳米管阵列样结构,通过水热处理方式可以进一步形成载锶纳米管样结构;表面改性极大的提高了多孔材料的亲水性。第二部分多孔钛合金材料的体外生物学功效的研究[目的]研究多孔Ti6Al4V支架的细胞活性,促成骨分化能力。[方法]采用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠的BMMSCs用于体外评价,包括采用CCK-8检测细胞增殖曲线,FE-SEM检测材料表面细胞形态,试剂盒检测ALP活性,q RT-PCR检测成骨相关基因表达水平;采用绿色荧光蛋白标记的r BMMSCs检测细胞分布,材料表面细胞的增殖行为。[结果]全骨髓贴壁法可成功分离培养SD大鼠BMMSCs并用于体外实验。对照组BMMSCs增殖能力最强,纳米管组次之,载锶纳米管组增殖能力最低,同样表面形貌下600μm试样比800μm试样增殖能力强;对照组表面BMMSCs形态呈铺展状,纳米管组表面BMMSCs呈长梭形,并伸出较长的板状伪足,载锶纳米管组表面BMMSCs呈圆饼样,高倍镜下见细胞发出大量的丝状伪足;ALP定量试剂盒显示载锶纳米管组具有更高的ALP活性,且600μm试样比800μm试样活性更强;成骨相关基因的表达水平检测显示载锶纳米管组活性较高,且600μm试样比800μm试样更高;细胞分布实验,对照组细胞主要分布在材料表面,随着深度的增加细胞数量递减明显,而纳米管组和载锶纳米管组表层细胞数量低于对照组,但深层细胞递减趋势不明显,与其他组底层相比,载锶纳米管组最底层细胞数量最多,且800μm试样比600μm试样细胞数量略多;材料表面的细胞增殖行为与增殖曲线的检测结果类似,随着时间的推移,细胞均可不断增殖并覆盖表层的孔洞。[结论]各组多孔Ti6Al4V支架均无明显的细胞毒性;纳米管组和载锶纳米管组抑制了细胞的增殖,但促进了细胞向成骨方向分化,尤其是载锶纳米管组;600μm试样的细胞增殖,分化能力均高于800μm试样,但试样内部细胞定植深度要逊于800μm试样。纳米管组和载锶纳米管组提高了支架内部的细胞定植能力。第三部分多孔钛合金材料的体内生物学功效的研究[目的]研究不同孔径,表面处理方式对多孔Ti6Al4V支架植入动物体内后促骨组织再生能力的影响。[方法]选取成年新西兰兔为研究对象,在其股骨外髁部植入多孔Ti6Al4V支架,术后4周和12周取材,分别采用Micro-CT分析骨再生情况,序列荧光标记和组织学切片VG染色分析骨长入情况。[结果]载锶纳米管组在4周和12周都表现出最高的促骨组织再生能力,纳米管组次之,对照组新生骨量最少,在同样表面处理条件下,600μm试样新生骨量大于800μm试样;序列荧光标记显示载锶纳米管组新生的骨组织形成时间要早于另两组;组织学切片VG染色显示载锶纳米管组新生骨组织分布更深入多孔材料中心,而800μm试样中心的新生骨组织要高于600μm试样。[结论]载锶纳米管涂层多孔Ti6Al4V支架具有更好的促骨组织长入和再生能力,对不同孔径而言,600μm骨组织再生能力更强,800μm骨组织长入能力更强。第四部分载锶纳米管涂层影响细胞功能的机制初探[目的]探索材料表面理化形貌与细胞内质网应激的关系。[方法]在钛片上接种BMMSCs,采用FE-SEM观察细胞形态,透射电镜观察细胞器形态,共聚焦显微镜观察细胞肌动蛋白微丝形态,采用Western Blot法检测内质网应激相关蛋白表达水平。[结果]与对照组相比,纳米管组和载锶纳米管组细胞厚度明显增加,载锶纳米管组的细胞骨架染色清晰粗壮,透射电镜显示载锶纳米管组细胞内质网腔扩张,Western Blot显示载锶纳米管组内质网应激相关的PERK-ATF4通路蛋白表达水平明显上调。[结论]载锶纳米管组引起了细胞骨架和形态的变化,并引起内质网应激相关蛋白表达水平上调。