超顺磁性氧化铁标记血管内皮祖细胞及移植治疗深静脉血栓的实验研究

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目的:研究超顺磁性氧化铁(superpara-magnetic iron oxide, SPIO)标记骨髓源血管内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)后,移植入大鼠深静脉血栓模型中进行活体干细胞示踪,为干细胞移植治疗深静脉血栓提供一种无创、有效的监测方法。方法:首先采用梯度离心结合贴壁法分离大鼠骨髓单个核细胞、诱导分化、培养扩增骨髓源性EPCs并进行鉴定。以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)修饰Fe3O4配制成新型SPIO,用六种不同浓度SPIO(0ug/ml、6.25ug/ml、12.5ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml)分别转染标记EPCs,对标记后的EPCs行Prussian blue染色、台盼蓝染色、透射电镜、MTT检测、流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期,比较不同SPIO浓度对EPCs标记效率、细胞活性及增殖的影响,确定最佳标记浓度和标记时间。采用明胶海绵栓塞法制作大鼠下腔静脉血栓模型后,分四组,每组10只:A组:SPIO标记EPCs移植组,移植1ml细胞悬液,含细胞约1×106/ml;B组:Dil标记EPCs移植组,移植1ml细胞悬液,含细胞约1×106/ml;C组,单纯EPCs组,移植1ml细胞悬液,含细胞约1×106/ml;D组,空白对照组,移植1ml培养基。各组移植入模型后分别于7、14、21、28d行磁共振检查(MRI),观察EPCs的定向迁移、归巢及分化能力。同时于7、14、21、28d取出血栓及血栓段下腔静脉,行HE染色及vWF免疫组化染色观察血栓机化再通情况。高倍显微镜下计数病理切片中血栓再通的毛细血管密度。采用SPSS17.0统计软件进行分析,P<0.05,差异有统计学意义。结果:梯密度离心结合贴壁法可成功分离出大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞并进行体外增殖分化。新型SPIO能有效标记EPCs,普鲁士兰染色显示EPCs呈浓度依赖性摄取SPIO,当培养基中SPIO浓度为25ug/ml时,标记效率最高,可见约90%以上EPCs普鲁士蓝染色阳性;当SPIO浓度为50ug/ml时,染色阳性细胞数约60%;当SPIO浓度为100ug/ml时,胞浆内看到极少蓝染颗粒<20%。因此,当浓度为25ug/ml时,标记效率与细胞活性达到最佳平衡,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。透射电镜可见EPCs超微结构保存良好,大量的高密度SPIO颗粒,主要位于溶酶体内、滑面内质网、线粒体等细胞器的膜结构上。细胞凋亡与周期检测表明SPIO标记对EPCs存活、增殖的能力无明显影响,标记后的EPCs可用于进一步干细胞示踪研究。干细胞移植后通过磁共振检查可观察到EPCs定向迁移归巢至下腔静脉血栓内,呈团块状的高密度影。病理HE染色及免疫组化染色观察到血栓再通后大量新生毛细血管形成,且表达CD34、vWF等内皮细胞特异性抗体标志,确定其由内皮细胞组成。结论:超顺磁性氧化铁能成功且高效地标记EPCs,在适当浓度下对EPCs的生物学活性没有影响。MRI示踪能为活体监测干细胞示踪奠定基础,为干细胞移植促进血栓机化再通,治疗深静脉血栓提供了一种新研究途径。
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