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【目的】观察1.0μmol/L亚砷酸钠（NaAsO2）长期作用于永生化人支气管上皮细胞（HBE细胞）、永生化人皮肤角质形成细胞（HaCaT细胞）,致使细胞发生恶性转化过程中,细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的动态变化趋势,并探讨转录因子Nrf2在此过程中所起的作用,为砷致癌机制的深入研究提供必要的基础资料。【方法】1.细胞模型:以本实验室前期建立的HBE、HaCaT细胞恶性转化模型为研究对象。用0.0和1.0μmol/L NaAsO2的DMEM高糖培养基传代培养HBE、HaCaT细胞分别至43代和35代,此时细胞已发生恶性转化。分别以染毒HBE细胞0、1、8、15、22、29、36、43代,HaCaT细胞0、1、7、14、21、28、35代,以及同代对照作为动态监测点。2.NaAsO2致细胞恶性转化过程中细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的检测:采用流式细胞仪检测HBE、HaCaT细胞恶性转化过程中染毒组各个监测点细胞凋亡率的变化;采用蛋白免疫印记法（Western blot）检测HBE、HaCaT细胞恶性转化过程中各个监测点的凋亡相关蛋白Caspase-3、Cleaved-caspase-3、Caspase-8、Cleaved-caspase-8、Caspase-12、Cleaved-caspase-12、CHOP、Bcl-2、Bax、Mcl-1蛋白的表达情况。3.转录因子Nrf2在NaAsO2致细胞恶性转化过程中对细胞凋亡的影响:分别取染毒43代的HBE细胞和染毒35代的HaCaT细胞进行软琼脂克隆,将软琼脂克隆实验中阳性（≥30个细胞）集落中的单个克隆细胞挑出,继续扩大培养,分别命名为恶性转化的HBE细胞（T-HBE Cells）及恶性转化的HaCaT细胞（T-HaCaT Cells）。再分别用Nrf2 si RNA转染T-HBE和T-HaCaT细胞,使细胞中的Nrf2表达降低,同时设立相应的同代对照组、恶性转化对照组、转染Con si RNA组,分别作为阴性对照组、阳性对照组和空白对照组。采用Western blot验证T-HBE和T-HaCaT细胞内Nrf2蛋白的沉默效果后,采用流式细胞仪检测Nrf2蛋白沉默后细胞凋亡率的变化;采用酶标仪检测Nrf2蛋白沉默后细胞内活性氧中的过氧化氢（H2O2）水平变化;同时再采用Western blot检测Nrf2蛋白沉默后细胞内的凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3、Caspase-3、Cleaved-caspase-8、Caspase-8、Cleaved-caspase-12、Caspase-12、CHOP、Bcl-2、Bax、Mcl-1蛋白的表达变化情况。【结果】1.NaAsO2致细胞恶性转化过程中细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的变化（1）分别培养各个监测点的HBE、HaCaT细胞检测凋亡率的变化,结果显示与对照组0代细胞相比较,HBE细胞在染毒22代及以后、HaCaT细胞在染毒7代及以后,细胞凋亡率都呈明显的下降趋势,差异均具有统计学意义（P<0.05）。（2）分别培养各个监测点的HBE、HaCaT细胞进行蛋白检测,结果显示Caspase-3、Cleaved-caspase-3蛋白及Cleaved-caspase-3/Caspase-3表达在HBE、HaCaT细胞中都有明显的下降趋势。在HBE细胞中,与对照组0代细胞及同代对照组细胞相比较,Caspase-3、Cleaved-caspase-3蛋白都在染毒22代及以后,Cleaved-caspase-3/Caspase-3表达分别在染毒15代及以后、染毒29代及以后,呈过低的表达状态（P<0.05）。在HaCaT细胞中,与对照组0代细胞及同代对照组细胞相比较,Caspase-3蛋白、Cleaved-caspase-3/Caspase-3表达都在染毒21代及以后,Cleaved-caspase-3蛋白分别在染毒14代及以后、染毒21代及以后,呈过低的表达状态（P<0.05）。（3）分别培养各个监测点的HBE、HaCaT细胞进行各个凋亡通路的蛋白检测,结果显示在HBE、HaCaT细胞恶性转化过程中Cleaved-caspase-8、Caspase-8、Cleaved-caspase-12、Caspase-12蛋白及Cleaved-caspase-8/Caspase-8、Cleaved-caspase-12/Caspase-12的表达并没有发生明显的改变。在HBE细胞中,与对照组0代及同代对照组细胞相比较,CHOP蛋白在染毒15代及以后、Bax蛋白在染毒29代及以后,呈明显的下降趋势（P<0.05）;Bcl-2、Mcl-1蛋白在染毒15代及以后呈明显的上升趋势（P<0.05）。在HaCaT细胞中,与对照组0代及同代对照组细胞相比较,CHOP、Bax蛋白在染毒21代及以后呈明显下降的过低表达状态;Bcl-2蛋白分别在染毒7代及以后和染毒14代及以后、Mcl-1蛋白在染毒14代及以后呈明显上升的过高表达状态（P<0.05）。2.转录因子Nrf2在NaAsO2致细胞恶性转化过程中对细胞凋亡的影响（1）用Nrf2 si RNA转染T-HBE和T-HaCaT细胞使Nrf2基因沉默后检测沉默效果。结果显示,相较于同代对照组的HBE和HaCaT细胞,T-HBE和T-HaCaT细胞的Nrf2蛋白表达均明显上升（P<0.05）;而相较于转染Con si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞,转染Nrf2 si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞Nrf2蛋白表达均明显下降（P<0.05）。（2）用Nrf2 si RNA转染T-HBE和T-HaCaT细胞使Nrf2基因沉默后进行检测。结果显示,相较于同代对照组的HBE和HaCaT细胞,T-HBE和T-HaCaT细胞的凋亡率、活性氧中的H2O2水平均明显下降（P<0.05）;而相较于转染Con si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞,转染Nrf2 si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞的凋亡率、H2O2水平均明显上升（P<0.05）。（3）用Nrf2 si RNA转染T-HBE和T-HaCaT细胞使Nrf2基因沉默后进行检测。结果显示,相较于同代对照组的HBE和HaCaT细胞,T-HBE和T-HaCaT细胞Cleaved-caspase-3、Caspase-3蛋白及Cleaved-caspase-3/Caspase-3表达均明显下降（P<0.05）;而相较于转染Con si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞,转染Nrf2 si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞Cleaved-caspase-3、Caspase-3蛋白及Cleaved-caspase-3/Caspase-3表达均明显上升（P<0.05）。（4）用Nrf2 si RNA转染T-HBE和T-HaCaT细胞使Nrf2基因沉默后进行检测。结果显示,相较于同代对照组的HBE和HaCaT细胞,T-HBE和T-HaCaT细胞的CHOP、Bax蛋白表达均明显下降,Bcl-2、Mcl-1蛋白表达均明显上升（P<0.05）,而Cleaved-caspase-8、Caspase-8、Cleaved-caspase-12、Caspase-12蛋白及Cleaved-caspase-8/Caspase-8、Cleaved-caspase-12/Caspase-12表达均未发生明显的改变;而相较于转染Con si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞,转染Nrf2 si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞CHOP、Bax蛋白表达均明显上升,Bcl-2、Mcl-1蛋白表达均明显下降（P<0.05）,而Cleaved-caspase-8、Caspase-8、Cleaved-caspase-12、Caspase-12蛋白及Cleaved-caspase-8/Caspase-8、Cleaved-caspase-12/Caspase-12表达仍未发生明显的改变。【结论】1.1.0μmol/L NaAsO2长期作用于HBE、HaCaT细胞致使其发生恶性转化过程中,细胞的凋亡率明显下降。2.NaAsO2可能通过抑制内质网和线粒体凋亡途径来抑制HBE、HaCaT细胞的正常凋亡,致使其发生恶性转化。3.Nrf2可能作为上游基因参与NaAsO2对HBE、HaCaT细胞凋亡的抑制作用。