论文部分内容阅读
研究背景:乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤,在遗传、基因表型、生物学行为等方面具有显著的多样性,并且已成为世界上最常见的癌症类型。乳腺癌的分子分型在治疗反应中起主要作用。雌激素受体α（Estrogen receptorα,ERα）是使用最广泛的乳腺癌分子标志物,由ESR1基因编码,其活性涉及多种与乳腺癌细胞增殖相关的基因转录。其中ER（α）阳性乳腺癌患者约占70-80%。放射治疗是乳腺癌治疗过程中至关重要的辅助治疗手段,可以明显降低保乳或全乳切除术后的局部复发率,并可延长淋巴结转移患者的无病生存期和总生存期。铁死亡是一种受严格调控的细胞程序性死亡形式,它不同于细胞凋亡、坏死和自噬,其特征是铁依赖性的脂质过氧化物积累。广泛的研究表明,铁死亡在肿瘤抑制过程中起着关键作用,而且能够对抗癌症治疗中的耐药性,为癌症治疗提供了新的机会。电离辐射（Ionizing radiation,IR）诱导机体产生的ROS能够攻击细胞脂质,引起质膜过氧化,从而引发铁死亡。因此放射治疗与铁死亡之间存在着紧密的联系。目前,乳腺癌的转移和耐药是癌症治疗过程所面临的最大挑战。能否通过IR诱导乳腺癌细胞发生铁死亡,提高放射治疗的有效性和降低复发风险需进一步明确。研究目的:探究铁死亡的关键调控因子SLC7A11在辐射诱导乳腺癌细胞铁死亡中的作用及调控机制,为乳腺癌辐射增敏寻找新的线索和理论依据。研究方法:1.对TCGA数据库中乳腺癌患者的1191份癌组织样本和112份正常组织样本的基因组表达数据进行差异分析,筛选与铁死亡相关的基因。2.依据乳腺癌组织中SLC7A11的表达水平将患者分为两组,通过卡方检验分析SLC7A11与患者临床资料的相关性。结合患者的生存资料,通过单因素与多因素Cox回归模型分析SLC7A11与乳腺癌患者的预后关系。通过K-M生存分析,研究SLC7A11与不同分子分型乳腺癌患者的预后关系。3.ER阳性细胞系MCF-7和ZR-75-1、ER阴性细胞系MDA-MB-231经IR（8Gy）处理后,采用q PCR和Western blot分别检测SLC7A11的m RNA及蛋白水平的时程变化。4.使用IR处理细胞,并分别在48和72小时通过流式细胞术检测细胞脂质过氧化和死亡水平。5.采用蛋白质免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）检测ESR1、NDEE4L、NDFIP1与SLC7A11之间的相互作用。6.采用双荧光素酶报告基因实验检测ESR1对SLC7A11以及EGR1对MALAT1的转录调控作用。7.通过与泛素（Ubiquitin,Ub）质粒共转染,采用IP实验检测SLC7A11的泛素化水平。研究结果:1.SLC7A11在乳腺癌组织中高表达,且与患者的预后不良有关通过对TCGA数据库中乳腺癌的基因表达数据进行差异分析发现,SLC7A11在乳腺癌组织中高表达,并且在ER阳性患者中表达较ER阴性低。卡方检验结果显示,SLC7A11的表达水平与乳腺癌患者的年龄、组织学类型、分子分型、ER状态、PR状态及N分期类型有关。采用单因素与多因素Cox回归分析发现,SLC7A11的表达水平是影响乳腺癌患者预后的独立因素。不同乳腺癌分子亚型的K-M生存分析显示,在ER阳性患者中,SLC7A11高表达预示着预后不良。2.SLC7A11参与调控IR诱导ER阳性乳腺癌细胞发生的铁死亡通过对不同乳腺癌细胞系进行IR处理发现,IR可以有效诱导ER阳性细胞MCF-7和ZR-75-1发生铁死亡,而在ER阴性细胞MDA-MB-231中IR诱导的铁死亡则不明显。在敲低SLC7A11之后,IR诱导的脂质过氧化和细胞死亡水平显著增加。在受到IR刺激后,SLC7A11的m RNA水平显著升高,之后恢复;SLC7A11的蛋白水平先升高,之后降低至基础表达水平之下。3.IR通过ESR1激活SLC7A11提高辐射抗性生信分析结果显示,在ER阳性乳腺癌患者中,ESR1与SLC7A11表达呈现正相关,并且ESR1高表达同样预示着患者较差的预后。在ER阳性细胞受到IR刺激后,ESR1与SLC7A11的m RNA水平均升高,但在蛋白水平ESR1升高之后,未与SLC7A11一同下降。抑制ESR1之后发现,SLC7A11的m RNA和蛋白水平也显著降低,并且过表达ESR1能够增强SLC7A11的转录活性和蛋白表达。另外,ESR1的敲低还能够抑制IR诱导的SLC7A11表达适应性升高。在细胞死亡方面,敲低ESR1能够增强IR诱导的细胞脂质过氧化和死亡水平,且此过程能够被SLC7A11的过表达所逆转。在ER阴性细胞MDA-MB-231中过表达ESR1,也可以降低IR诱导的细胞脂质过氧化和死亡水平。4.IR通过泛素化途径诱导SLC7A11发生降解IR诱导的SLC7A11降解能够被蛋白酶体抑制剂MG132所逆转。在敲低E3泛素连接酶NEDD4L之后,IR诱导的SLC7A11降解同样能够被抑制。通过IP及泛素化IP实验进一步证实,IR可以增强NEDD4L和SLC7A11之间的相互作用,并且提高SLC7A11的泛素化水平。5.EGR1-MALAT1-NDFIP1-NEDD4L轴参与IR诱导的SLC7A11泛素化降解在IR诱导下,EGR1首先被激活,进而促进MALAT1的转录,然后引起SLC7A11的泛素化降解,最终导致乳腺癌细胞发生铁死亡。单独过表达MALAT1,能够使SLC7A11发生泛素化降解,并且可以增加乳腺癌细胞铁死亡水平。NEDD4L的衔接蛋白NDFIP1,与NEDD4L的共转染能够显著提高SLC7A11的泛素化水平。抑制NDFIP1能够同时抑制MALAT1及IR单独诱导的SLC7A11泛素化降解,并且还能够降低其诱导的细胞脂质过氧化和死亡水平。研究结论:1.SLC7A11在乳腺癌组织中高表达,且与ER阳性患者的预后不良有关。2.在ER阳性乳腺癌患者中,ESR1与SLC7A11的表达正相关,且ESR1高表达预示着预后不良。3.SLC7A11参与调控IR诱导ER阳性乳腺癌细胞发生的铁死亡。4.IR通过ESR1激活SLC7A11的转录活性,抑制细胞发生铁死亡,发挥辐射抗性。5.IR通过诱导由NEDD4L介导的SLC7A11泛素化降解,引起细胞发生铁死亡。6.IR通过EGR1激活MALAT1的转录,促进SLC7A11的降解,发挥辐射增敏作用。7.NEDD4L的衔接蛋白NDFIP1介导MALAT1诱导的SLC7A11泛素化降解,发挥辐射增敏作用。