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研究背景卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率和病死率逐年升高，5年生存率仍仅为20%-30%。初步研究VEGF基因差异剪接后能够产生表达8a外显子的VEGFxxx亚家族，具有促进血管生成的活性；表达8b外显子的VEGFxxxb亚家族，具有抑制血管生成的活性。Mineur等报道了一种新的VEGFxxx亚家族成员VEGF111，证实其能够通过激活VEGFR2促进血管生成，那么是否存在相对应的VEGF111b剪接变异体至今尚未被证实。研究目的1.证实VEGF111b存在，构建VEGF111b真核表达系统；2.研究VEGF111b对卵巢癌血管生成的作用并探讨其作用机制；3.研究VEGF111b对卵巢癌生长的作用并探讨其作用机制。研究方法1.应用RT-PCR方法从丝裂霉素C处理过的人卵巢癌SKOV3细胞中扩增出VEGF111b基因，将之连接至pcDNA3.1质粒构建VEGF111b真核表达载体；2.使用VEGF111b特异性抗原肽CRSLTRKD制备VEGF111b多克隆抗体，应用RT-PCR和Western blot检测方法证实VEGF111b基因及蛋白在卵巢癌细胞中诱导性表达；3.使用LipofectaminTM2000将VEGF111b转染卵巢癌细胞，通过G418压力筛选稳定转染株，应用Western blot方法检测卵巢癌细胞内及上清液中VEGF111b蛋白的过表达；4.应用MTT比色法检测VEGF111b对血管内皮细胞及卵巢癌细胞增殖能力的影响；5.应用“划痕”迁移实验和Transwell小室检测VEGF111b对血管内皮细胞迁移能力的影响；6.应用小管形成实验检测VEGF111b对血管内皮细胞小管形成能力的影响；7.应用Western blot方法检测VEGF111b抑制血管生成的机制及信号通路；8.应用细胞平板克隆形成实验检测VEGF111b对卵巢癌细胞长期增殖能力的影响；9.应用细胞DNA含量检测（细胞周期实验）检测VEGF111b对卵巢癌细胞周期的影响；10.制备稳定转染VEGF111b人卵巢癌细胞SKOV3荷瘤裸鼠模型，观察裸鼠移植瘤生长情况，接种后20天剥离移植瘤称重。应用免疫组织化学染色法检测增殖蛋白Ki67和PCNA，血管化蛋白VEGF和CD31的表达情况。研究结果1.证实了VEGF111b基因在丝裂霉素C处理的卵巢癌细胞中存在，从中扩增出VEGF111b基因，并连接至pcDNA3.1质粒，经过双酶切鉴定及克隆测序鉴定，成功构建了VEGF111b真核表达载体，测序结果与预测完全相符；2.成功制备了VEGF111b多克隆抗体，并证实VEGF111b蛋白在卵巢癌细胞中诱导性表达；3.制备了VEGF111b稳定转染的卵巢癌细胞株，并证实VEGF111b蛋白在卵巢癌细胞内及上清液中过表达；4. VEGF111b显著抑制血管内皮细胞的增殖，24h和48h增殖抑制率分别达到26±8%和38±10%；5.细胞“划痕”迁移实验VEGF111b显著抑制血管内皮细胞的迁移距离，8h和16h抑制率分别为43%±11%和61%±13%；Transwell实验VEGF111b显著抑制血管内皮细胞的迁移数量，抑制率为28%±7%；6. VEGF111b显著抑制血管内皮细胞的小管形成能力；7. VEGF111b抑制血管内皮细胞膜上的VEGF-R2磷酸化，及其下游信号传导分子ERK1/2、PI3K和Akt1的磷酸化；8. VEGF111b显著抑制卵巢癌细胞的增殖，对SKOV3细胞48h和72h增殖抑制率分别达到40±7%和50±11%，对OVCAR3细胞48h和72h增殖抑制率分别达到25±10%和42±12%；9. VEGF111b明显抑制SKOV3和OVCAR3细胞的克隆形成；10. VEGF111b使卵巢癌细胞阻滞在S期；11. VEGF111b抑制卵巢癌细胞膜上的VEGF-R2磷酸化，及其下游信号传导分子ERK1/2、PI3K和Akt1的磷酸化；12. VEGF111b显著抑制卵巢癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，VEGF111b组移植瘤组织细胞胞核增殖蛋白Ki67和PCNA着色明显减弱，胞浆血管化蛋白VEGF和CD31着色明显减弱。结论1.发现了一个新的VEGF剪接异构体—VEGF111b基因，成功获得了VEGF111b基因序列。2.成功制备了VEGF111b多克隆抗体,证实VEGF111b基因及蛋白在卵巢癌细胞SKOV3及OVCAR中诱导性表达。3. VEGF111b抑制血管内皮细胞的增殖、迁移及小管形成能力，抑制血管生成。4. VEGF111b通过与内皮细胞表面的VEGF-R2结合并抑制其磷酸化，进而抑制其下游信号传导分子PI3K/Akt1和ERK1/2的磷酸化，从而抑制血管生成活性。5. VEGF111b显著抑制卵巢癌细胞的增殖能力，抑制肿瘤生长6. VEGF111b使卵巢癌细胞阻滞在S期。7. VEGF111b通过与内皮细胞表面的VEGF-R2结合并抑制其磷酸化，进而抑制其下游信号传导分子PI3K/Akt1和ERK1/2的磷酸化，从而抑制卵巢癌细胞的增殖。8. VEGF111b显著抑制卵巢癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，与抑制体内成瘤的增殖和血管生成有关。