极端嗜热厌氧纤维素分解菌分子特征研究及邦2菌的β-葡萄糖苷酶基因克隆

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纤维素的分解方式主要有酸水解、氧化降解、微生物降解、热降解、机械降解、离子辐射降解等多种方式。其中纤维素的微生物降解是维持自然界碳循环的中心环节。近年来,已有多种细菌和真菌纤维素酶基因被克隆(目前已有40多种细菌纤维素酶基因被克隆[3,4]),并在大肠杆菌E.coli或者其它受体菌中得到表达。厌氧纤维素分解菌的酶系与耗氧纤维素分解菌的酶系存在差异,具有特殊性,可以给纤维素生物转化带来新的材料和技术基础。使用纤维素酶的工业中许多工艺均附带一定的高温条件,嗜热纤维素酶将发挥极大应用潜能。从农业部沼气所获得多株高温严格厌氧纤维素分解细菌(邦系列极端嗜热厌氧纤维素分解菌)。通过随机扩增性多态DNA(RAPD)的方法来研究六株高温厌氧纤维素分解菌的遗传性多态,并构建其系统亲缘关系图。这些高温厌氧纤维素分解菌中纤维素分解能力最强,产酶活性最高、最稳定的厌氧纤维素分解菌是邦2菌。对邦2细菌进行16SrDNA的PCR扩增,序列测定,序列分析结果显示它与产乙醇热厌氧杆菌亚属(Tab.ethanolicus_subgroup)具有99.8%的相似性;邦2菌被鉴定为热厌氧纤维菌属(Thermoanaerobacter)。   本文以邦2菌为材料,制备其总DNA,经限制性核酸内切酶HindⅢ部分酶切后,在T4DNA连接酶的作用下与经HindⅢ完全酶切、去磷酸化的质粒载体pUC18连接,然后转化E.coliJM109,建立了邦2的基因组文库,经筛选鉴定得到5278个重组子;经过七叶苷(esculin)平板筛选法:约有0.26%黑色菌落产生;重组子经HindⅢ酶切验证显示:重组质粒均含有外源DNA插入片段。结果表明已克隆到邦2菌纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶(GL)基因。提取重组质粒,通过HindⅢ酶切分析,发现插入的外源DNA片段约为700bp左右。
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