RNA病毒基因组较DNA病毒难以操作,对其进行研究必须先通过反向遗传学技术构建其感染性克隆。随着各类研究方法和实验技术手段的不断更新,反向遗传学技术也在与时俱进,各种新型的回复系统不断建立。传统的基于原核启动子的回复系统的局限都是感染哺乳细胞时需要通过烦琐的步骤来产生RNA聚合酶,增加了实验操作的难度,而且一些产生聚合酶的手段,如使用辅助病毒等,本身就会对实验有所干扰甚至由于辅助病毒对细胞的病变效应(CPE)会影响负载细胞的生存而导致病毒回复无法进行。真核细胞都可以合成自身的RNA聚合酶,而且这些RNA聚合酶是真核细胞的内源蛋白,不需要通过辅助手段(如上述的辅助病毒,辅助质粒,构建细胞系等)去产生就可以启动真核启动子的表达,十分方便,也从根本上杜绝了原核RNA聚合酶回复系统利用辅助病毒等对细胞CPE的发生；另外真核RNA聚合酶有的定位在细胞核,有的定位于细胞质,为回复各种类型的病毒都提供了可能。目前,真核RNA聚合酶回复系统的优越性已经越来越明显,成为RNA病毒回复系统的研究热点。柯萨奇病毒(Coxsackie virus, CV)是一类常见的经呼吸道和消化道感染人体的病毒,属于微小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus genus)。柯萨奇病毒血清型分A,B两组,A组有24个血清型,B组有6个血清型,能起一系列的临床疾病。科萨奇病毒B组3型(CVB3)基因组为单股正链RNA,编码一个大的开放读码框包括2207个氨基酸,两侧为5’非编码区(5’-NTR)和3’多聚腺苷非编码区。5’-NTR包括一个Ⅰ型核糖体进入位点(IRE)使5’帽子能够独立翻译成病毒多聚蛋白的起始。由于单股正链结构,病毒基因组可以被核糖体立即翻译来产生进行病毒生活周期下一步所需要的多肽。CVB3的复制不经过DNA的中间体,研究其结构和功能比较困难,必须依赖反向遗传学操作技术得到该病毒的感染性克隆。在感染性克隆的构建过程中,设计一个有效的回复载体是至关重要的。鉴于传统回复载体的缺陷,本研究设计了一个RNA聚合酶Ⅱ驱动的病毒回复载体。利用CMV启动子构建CVB3感染性克隆载体：先将质粒pcDNA3.1(+)的CMV启动子下游区域通过PCR技术替换成设计好的多克隆位点区,分别插入PCR合成的HdvRz核心序列和polyA尾片段,形成框架载体pc-H-A,通过瞬时转染Hela细胞初步鉴定pc-H-A的可用性；同时,为了得到CVB3病毒的全长序列,本研究用我室CVB3 (nancy株)感染来Hela细胞,取感染液上清提取病毒RNA,利用长链RT-PCR和长链PCR技术反复优化条件扩增病毒基因组全长片段；最后,将CVB3全长基因组序列克隆至设计好的框架载体pc-H-A中,筛选阳性克隆,并对筛选到的CVB3重组全长克隆其进行测序鉴定和初步回复功能评价。综上所述,本研究构建了带有CMV启动子的回复框架载体pc-H-A并初步鉴定了该载体可用,利用此框架载体构建了与基因库中序列相似性为98%的CVB3全长cDNA克隆pc-CVB3-H-A并在转录水平进行分析,同时进行了转染和盲传实验检测有无子代病毒。虽然该系统回复正链RNA病毒的有效性仍需进一步研究探讨,但该研究为RNA聚合酶Ⅱ型回复系统的研究奠定了基础。