猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起猪的一种高度接触性传染病,以妊娠母猪繁殖障碍及新生仔猪的呼吸困难为主要特征。我国自2006年出现和流行的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株(HR-PRRSV)更是给我国养猪业造成了巨大的经济损失。病毒样颗粒作为新型疫苗研发的平台,其构象更接近于天然病毒,具有良好的抗体反应性和免疫原性,且安全性更高。为了进一步提高PRRSV VLPs的免疫特性,本研究对PRRSV BB0907株GP5的糖基化位点进行了修饰,构建了表达PRRSV VLPs的重组杆状病毒,并对小鼠进行免疫原性分析。具体研究内容如下：1. PRRSV截短GP5蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立由于完整的GP5蛋白在原核表达系统中难以表达,所以本研究选择GP5蛋白C端130-200位的氨基酸进行原核表达,以纯化的重组蛋白tGP5为免疫原,进行BALB/c小鼠免疫,制备多克隆抗血清。虽然血清能够与重组蛋白产生特异性反应,而且ELISA方法检测也显示获得了高效价的多克隆抗体,但病毒中和试验结果却显示该抗体没有中和活性。目前尚无有效的血清学检测方法来评价猪群疫苗免疫或感染后抗体水平与免疫保护力之间的关系。为建立PRRSV GP5蛋白的ELISA方法,选择纯化的重组蛋白tGP5为包被抗原建立了检测针对GP5蛋白抗体的ELISA方法,优化后反应条件为：抗原包被浓度2μg/mL,37℃包被2 h,5%脱脂乳37℃封闭2 h,待检血清稀释度1：100,37℃作用1 h,二抗1：20000稀释,37℃作用45 min,37℃显色3 mmin,抗体临界值OD450nm≥0.22判为阳性,OD450nm<0.183判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。用该方法检测判定的30份阴、阳性血清来做中和试验,结果显示中和试验判定结果与该方法不一致,说明用E.cloi表达的130-200位的tGP5蛋白建立的间接ELISA方法不能代替中和试验来评价猪群抗体水平与免疫保护力之间的关系。2.GP5基因糖基化位点对VLPs形成的影响为了研究GP5糖基化位点对VLPs形成的影响,本研究对PRRSV GP5的四个糖基化位点GN30S、GN35S、GN44S、GN51S分别进行了突变,同时在GP5基因A表位和B表位之间插入一段含有27个碱基序列的HA标签,以GP5基因原始序列为对照,设计了8对引物,利用重叠延伸PCR扩增目的基因片段,分别克隆至昆虫杆状病毒表达系统的pFastBac Dual载体上,经PCR、双酶切和基因测序鉴定得到的重组质粒,同时构建共同表达M蛋白和N蛋白的重组质粒。构建好的重组质粒分别转入DH10Bac感受态细菌中,经两轮蓝白斑筛选和菌液PCR鉴定得到重组Bacmid质粒。最后在脂质体的介导下将重组Bacmid质粒转染至Sf9细胞中,得到7种重组杆状病毒。然后将6种GP5重组杆状病毒分别与rBac-MN共同感染Sf9细胞,经Western-blot鉴定后进行透射电镜观察,结果显示6种GP5重组杆状病毒在电镜下均能观察到VLPs,说明单个突变GP5糖基化位点不会影响PRRSV VLPs 6勺组装,A/B表位之间插入小段HA标签也不会影响VLPs的形成。3.杆状病毒表达的PRRSV VLPs的免疫原性分析为了探讨上述构建的6种PRRSV VLPs免疫特性,本研究选择48只BALB/c小鼠,分为8组,每组6只。设Sf9细胞裂解物为阴性对照、PRRSV疫苗为阳性对照,与上述得到的6种PRRSV VLPs同时免疫小鼠,经三次免疫分析上述VLPs的免疫效果。每次免疫后检测GP5蛋白ELISA抗体效价,二免、三免后均测定中和抗体的效价和细胞因子IL-4和IFN-y含量的变化。结果为：首免三周后测定的ELISA抗体较低,二免、三免后抗体水平进一步提高,8组中rBac-GP5/MN形成的VLPs产生的抗体水平最高,rBac-GP5(HA)/MN产生的抗体水平略高于其他组,阴性组最低；二免、三免后均未能检测到中和抗体；细胞因子含量变化也不明显。说明单个糖基化位点突变及A/B表位之间插入HA标签影响PRRSV VLPs的免疫特性,且未经纯化的低含量的VLPs不能产生中和抗体。