核仁小分子RNA(snoRNA)是细胞核内非编码RNA的重要组成部分，主要包括两类：boxC/DsnoRNA和boxH/ACAsnoRNA。大多数snoRNA指导rRNA和snRNA上的两类核苷酸共价修饰，即2’-O-核糖甲基化和假尿嘧啶化修饰。还有一部分snoRNA在rRNA前体的剪接加工过程中起重要作用。近几年的研究表明，snoRNA的结构、功能及基因组织形式均呈现高度多样性。通过不同的实验方法和生物信息学方法，对多种模式生物如酵母、水稻、果蝇等进行了大规模的snoRNA鉴定与分析。由于人的基因组与其它生物相比更加复杂，所以早期研究只限于snoRNA的小规模鉴定。本研究开始时，人的rRNA上的109个2’-O-核糖甲基化修饰和97个假尿嘧啶化修饰位点，分别有70个和79个位点找到了相应的boxC/DsnoRNA和boxH/ACAsnoRNAsnoRNA，还有一部分snoRNA有待进一步发现。 BoxH/ACAsnoRNA保守的结构特征之一为3’末端序列为ACANNN；而boxC/DsnoRNA的3’末端和5’端分别具有保守序列元件boxD(CUGA)和boxC(UGAUGA)，box元件距离末端多数为几个核苷酸。根据snoRNA的这种序列特征，本论文建立了一种新的实验方法—锚定引物介导的定向克隆技术，通过锚定3’端boxACA或boxD靶向引物介导的定向RT-PCR，有效地从总RNA富集boxH/ACAsnoRNA或boxC/DsnoRNA，从而建立特异的cDNA文库，并进行了snoRNA的大规模鉴定分析。 利用锚定引物dT16-TGT，对人的血液细胞总RNA构建了两个不同大小的H/ACAcDNA文库，Ⅰ和Ⅱ，同时用普通引物OligodT构建了一个对照文库。测序分析表明，在文库Ⅰ中，boxH/ACAsnoRNA的含量为64％，而对照文库仅为16％。在锚定文库中，rRNA、snRNA等的污染大大减少。对文库Ⅰ随机测了115个克隆子，其中boxH/ACAsnoRNA的种类为35种，除了具有AUA尾的ACA25，锚定文库基本包括了对照文库中的种类。 从人的血液细胞中共获得了47种boxH/ACAsnoRNA，其中7种是本研究通过实验方法首次鉴定。ACA3及其变体ACA3-2位于同一蛋白基因的不同内含子中，这与以前发现的部分snoRNA情况是一致的。而U107及它的两个变体分别位于黑色素瘤相关基因MAGED2、MAGED3、MAGED4的第10号内含子中，并且是人所特有的。早期的研究认为U19位于非编码蛋白基因U19HG，并且是singleton。而本研究得到了U19的变体U19-2，此变体位于ATP6V0E蛋白基因的内含子中。说明不同的snoRNA及其变体的加工机制及进化过程存在一定差别。 部分boxC/DsnoRNA的boxC上游为几十个核苷酸，如U3、U8等。为了全面的对boxC/DsnoRNA进行分析，我们利用不同的引物建立了两套锚定文库，即只锚定boxD的单锚文库和boxC和boxD都锚定的双锚文库。测序分析结果表明，单锚、双锚文库中虽然有一部分snoRNA种类是相同的，但半数以上是不同的，二者可以互补。因此结合应用单锚和双锚方法可以更好地对boxC/DsnoRNA进行系统分析鉴定。从人的血液细胞中共获得52种boxC/DsnoRNA分子，其中13种是新的。一部分指导6个rRNA和1个snRNA上的核糖甲基化位点，另一部分是orphansnoRNA。 在boxC/DsnoRNA文库中发现了U8的另一种分子形式—U8-S，此分子缺少U8完整分子5’端的46个核苷酸。在人的不同细胞及小鼠、大鼠不同组织中用特异性探针进行Northern杂交分析，结果表明U8-S是普遍且稳定存在的。Blastn分析发现人的基因组中U8位于MGC10744蛋白质基因的3’-UTR区，并且U8具有多个反转座基因。U8-S的加工机制及作用还有待深入研究。 以上结果表明，运用特异的锚定引物构建cDNA文库可以高效快速地分离和鉴定snoRNA基因，从而对其进行系统分析。本方法可以应用于广谱模式生物的snoRNA大规模鉴定，如裂殖酵母、果蝇、水稻等，从而为研究snoRNA的结构和功能奠定了基础，对揭示snoRNA的进化及细胞中的各种生命现象具有重要作用。 近几年来，生物信息学方法鉴定snoRNA的研究发展迅速，大量的snoRNA候选分子有待高效快速的实验方法鉴定。此外，snoRNA的结构和功能具有多样性，而生物信息学的方法只能寻找具有保守特征的snoRNA，对于新的具有独特序列元件或结构的snoRNA如杂合snoRNA难以发现。锚定引物法并不受snoRNA内部结构变化的限制，对于所有具有保守末端元件序列的snoRNA都是适用的。因此锚定引物法可以与生物信息学的方法结合起来对snoRNA进行基因组水平的大规模鉴定。