酶催化的混乱性（enzyme promiscuity）是指单一的酶能够催化多种不同类型的化学反应，是生物体适应不同环境、产生多样化代谢产物的重要分子基础。本文以来源于Microbacterium hydrocarbonoxydans的(-)γ-内酰胺酶Mhg为模型，发展了鉴定其新催化活性的方法，并且发现催化活性中心关键残基的突变能够实现酶不同催化活性的分离。此外，通过蛋白质工程手段进一步改造了Mhg的催化活性，取得如下研究成果:　　一、Mhg多功能催化活性的鉴定　　通过蛋白质三维结构相似性搜索结合实验验证鉴定了Mhg具有过水解酶的新催化活性。此外，实验结果还表明两种酶催化活性由同一个催化三联体Ser98-His259-Asp230实现。通过对两种酶活的动力学分析表明，Mhg的过水解酶活力具有较高的催化活性和底物亲和力，说明过水解酶才是Mhg的天然活性，而(-)γ-内酰胺酶可能其是在进化过程中获得的一种催化活性。　　二、Mhg底物结合口袋的结构功能研究　　由于Mhg的(-)γ-内酰胺酶活力和过水解酶活力由同一活性中心催化，推测其底物结合口袋在催化过程中起到关键的作用。对底物结合口袋的氨基酸残基的丙氨酸扫描突变实验结果表明，Leu233残基对酶的催化活性、蛋白质可溶性表达、酶的最适温度等方面都具有重要的影响。接下来对该位点进行的饱和突变表明对Leu233残基的突变能够实现酶不同催化活性的分离，获得具有单一活性的酶。突变体L233A、L233P和L233T只保留其(-)γ-内酰胺酶活力;而突变体L233M只保留其过水解酶活力。该位点的突变还极大地影响了蛋白的可溶性表达，导致蛋白全部可溶性表达或全部形成包涵体;此外，该位点的突变对蛋白质热稳定性也造成了一定的影响。对突变体进一步的分子对接从理论上为我们揭示了突变与(-)γ-内酰胺酶活力变化之间的关系。　　三、通过理性设计重建Mhg的环氧化物水解酶活性　　对Mhg进行的蛋白质三维结构相似性搜索结果表明，其与来源于Aspergillus niger的环氧化物水解酶(PDB ID:1QO7)有着较高的结构相似性，但是Mhg并没有表现出环氧化物水解酶的活力。在本章中，我们通过理性设计的手段对Mhg改造，重建其环氧化物水解酶的活性。Mhg底物结合口袋中的两个氨基酸Phe162和Phe166突变为Tyr可以赋予Mhg环氧化物水解酶的活力，但是突变体的(-)γ-内酰胺酶活力和过水解酶活力有着不同程度的降低，表明酶的多种催化活性之间存在trade-off。　　四、通过定向进化重建Mhg的芳基酯酶活力　　Mhg与来源于Pseudomonas fluorescens的芳基酯酶(PDB ID:1VA4)也具有较高的结构相似性，但是Mhg不具有酯酶的催化活力。因此，我们通过定向进化的手段，构建突变库和建立高通量筛选体系，重建Mhg的芳基酯酶活力。但是，目前对于突变库的筛选还没有得到具有芳基酯酶活性的突变体。　　本课题证明了蛋白质三维结构相似性搜索结合实验验证能够有效地鉴定酶的多功能催化活性;对多功能酶底物结合口袋的改造能够有效获得单一催化活性的突变体;基于蛋白质结构与功能的关系，通过理性设计的手段能够成功改造酶的催化活性。这些发现增进了我们对Mhg多功能催化活性机理的理解，也为蛋白质工程改造多功能酶的催化活性提供了宝贵的借鉴。