近年来,由于农药和塑化剂在农业和工业生产过程中的大量应用以及不受控制和不合理的使用,这两类重要化学污染物对食品安全和人类健康产生的不利影响引起越来越多的关注。蛋白质作为生命体的必要组成成分,其结构的变化可能会造成生命体产生结构性或功能性的损伤,导致某些疾病。污染物小分子通过直接或间接途径进入机体后,可能会对机体蛋白质产生毒性作用,诱导蛋白质结构发生变化,进而影响蛋白质的生物学功能。本文以人血清白蛋白和胰蛋白酶为蛋白模型,运用多种光谱学手段结合分子模拟等技术研究了农药扑草净以及几种邻苯二甲酸酯类塑化剂与蛋白质的结合机制,探讨了这几种化学污染物对蛋白质结构功能的影响。本研究对从分子水平上了解污染物小分子在体内的分布、转运、代谢及毒性作用提供重要信息。本文主要内容如下:1.简要介绍了蛋白质的结构、功能及生物学性质,同时对小分子与蛋白质相互作用的主要研究方法进行了概述。2.运用多种光谱学方法包括荧光光谱法、紫外-可见吸收光谱法、圆二色谱法和红外光谱法结合分子模拟技术,在模拟生理条件下(pH 7.4)研究了扑草净与人血清白蛋白(HSA)的结合特性以及蛋白质结构的变化。荧光数据显示扑草净对HSA的荧光猝灭为静态猝灭过程,两者之间的结合常数达103数量级,说明扑草净与HSA具有中等强度的结合能力。负的焓变值和正的熵变值表明扑草净与HSA的结合过程主要由疏水作用和氢键驱动。位点竞争实验显示扑草净的结合位点为site I,分子模拟结果显示,扑草净结合在HSA亚域IIA的疏水空腔,即site I,证实了位点竞争实验结果。紫外-可见吸收光谱、同步荧光光谱、圆二色谱和红外光谱分析表明,扑草净的加入导致HSA多肽链部分伸展,结构发生变化,α-螺旋含量降低伴随着β-折叠、β-转角和无规则卷曲含量的增加。3.采用多种光谱方法和分子模拟技术测定了塑化剂邻苯二甲酸二正辛酯(DnOP)和邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)与HSA的相互作用模式。结果表明,DnOP和DEHP对HSA内源荧光的猝灭机制为形成复合物的静态猝灭,疏水作用和氢键为主要作用力,DEHP与HSA的亲和力略强于DnOP。DnOP和DEHP均结合于HSA亚结构域IIA(site I位),导致HSA二级结构发生变化,降低了HSA的α-螺旋的含量,并且DEHP诱导HSA多肽链的伸展程度强于DnOP。蛋白质表面疏水性研究发现两种塑化剂的结合导致蛋白质表面疏水性增加,即蛋白质疏水空腔的暴露程度增加。同时,以吖啶橙(AO)作为荧光探针,通过优化实验条件,利用荧光光谱法对DnOP和DEHP进行定量分析,AO的荧光强度差值与DnOP和DEHP含量在1.20-11.76×10-5 mol L–1范围内呈良好线性关系,检出限分别为1.15×10-5 mol L–1和1.02×10-5 mol L–1。4.在模拟人体生理条件下(pH 7.4),应用荧光光谱法、紫外光谱法和圆二色谱法并结合原子力显微镜和分子模拟技术,研究了邻苯二甲酸二甲酯(DMP)和邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对胰蛋白酶的光谱性质、结构及催化活性的影响。DMP和DBP通过与胰蛋白酶结合形成基态复合物而猝灭胰蛋白酶的内源荧光,且在胰蛋白酶上都只有一个结合位点。298 K时,两者与胰蛋白酶相互作用的结合常数分别为3.92×103 L mol-1和4.94×103 L mol-1,DBP与胰蛋白酶的亲和能力略强于DMP。同步荧光光谱、紫外光谱、圆二色谱和红外光谱分析表明,DMP、DBP的加入均导致酶构象发生变化,蛋白质多肽链重排。分子模拟和酶活性测定结果显示,DMP、DBP主要与胰蛋白酶的催化三联体(His57,Asp102和Ser195)发生相互作用,导致酶活性被抑制。原子力显微镜图像显示,DMP、DBP的存在引起胰蛋白酶的表面形态发生变化,蛋白质发生聚集。在pH 7.0的BR缓冲液中,DMP、DBP的荧光强度与浓度之间存在线性关系,线性范围为3.32-47.62×10–7mol L-1,DMP和DBP的检出限分别为1.58×10–7 mol L-1和2.43×10–7 mol L–1。